https://bit.ly/BullDmsc วารสาร กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Vol. 64 No. 2 April - June 2022 BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES 80 ปี กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ วิจัยและพัฒนา เพื่อสุขภาพที่ดีของคนไทย ว กรมวิทย พ 64 (2) เม.ย. - มิ.ย. 2565 Bull Dept Med Sci 64 (2) April - June 2022 https://bit.ly/BullDmsc วารสาร กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Vol. 64 No. 2 April - June 2022 BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES 80 ปี กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ วิจัยและพัฒนา เพื่อสุขภาพที่ดีของคนไทย

วารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์ ์ วารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์จััดทำโดยกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์กระทรวงสาธารณสุุข เพื่่�อเผยแพร่่ผลงาน วิิชาการด้้านวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ทุุกสาขา เจ้้าของ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์กระทรวงสาธารณสุุข ที่่�ปรึึกษาด้้านบริิหาร นพ.ศุุภกิิจ ศิิริิลัักษณ์์ นพ.พิิเชฐ บััญญััติิ นพ.บััลลัังก์์ อุุปพงษ์์ นพ.ปิิยะ ศิิริิลัักษณ์์ ที่่�ปรึึกษาด้้านวิิชาการ นางพิิมพ์์ใจ นััยโกวิิท ดร.สุุมล ปวิิตรานนท์์ ดร.ปนััดดา ซิิลวา ดร.เดืือนถนอม พรหมขััติิแก้้ว ดร.บุุษราวรรณ ศรีีวรรธนะ บรรณาธิิการบริิหาร ดร.ประไพ วงศ์์สิินคงมั่่�น บรรณาธิิการ ดร.อภิิวััฎ ธวััชสิิน รองบรรณาธิิการ นางสิิริิภากร แสงกิิจพร ดร.อุุรุุญากร จัันทร์์แสง ดร.นวลจัันทร์์ วิิจัักษณ์์จิินดา คณะบรรณาธิิการ ศ.เกีียรติิคุุณ ดร.พิิไลพัันธ์์ พุุธวััฒนะ มหาวิิทยาลััยมหิิดล ศ.ดร.นพ.ประเสริิฐ เอื้้�อวรากุุล มหาวิิทยาลััยมหิิดล ดร.ดนััย ทิิวาเวช มหาวิิทยาลััยนเรศวร ภญ.สุุวรรณา จารุุนุุช มหาวิิทยาลััยหััวเฉีียวเฉลิิมพระเกีียรติิ ศ.ดร.นพ.เผด็็จ สิิริิยะเสถีียร จุุฬาลงกรณ์์มหาวิิทยาลััย ศ.ดร.พรพิิมล กองทิิพย์์ มหาวิิทยาลััยมหิิดล รศ.ดร.ศรีีสุุรางค์์ ตัันติิมาวานิิช มหาวิิทยาลััยมหิิดล ดร.สุุณีี ศิิริิวิิชยกุุล จุุฬาลงกรณ์์มหาวิิทยาลััย รศ.ดร.ภญ.ชนิิตรา ธุุวจิิตต์์ มหาวิิทยาลััยมหิิดล รศ.ดร.ภญ.พิิณทิิพย์์ พงษ์์เพชร นัักวิิชาการอิิสระ ดร.สลัักจิิต ชุุติิพงษ์์วิิเวท นัักวิิชาการอิิสระ ดร.อุุษาวดีี ถาวระ นัักวิิชาการอิิสระ นายสุุธน วงษ์์ชีีรีี นัักวิิชาการอิิสระ นางวิิชชุุดา จริิยะพัันธุ์์ นัักวิิชาการอิิสระ ดร.สุุภาณีี ดวงธีีรปรีีชา นัักวิิชาการอิิสระ รศ.ดร.นวลฉวีี เวชประสิิทธิ์์� นัักวิิชาการอิิสระ ดร.วัันทนา ปวีีณกิิตติิพร กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ ดร.ปิิยะดา หวัังรุ่่งทรััพย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ ฝ่่ายจััดการ นางสาวน้้ำฝน น้้อยประเสริิฐ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ นางสาวประสาน จุุลวงษ์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ นางสาวอภิิมน จิิรพงศธร กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ นายนาวีี ศรีีวรมย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ นางสาวภาวิิณีี สุุขเจริิญ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ สำนัักงานวารสาร กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ 88/7 ซอยติิวานนท์์14 ถนนติิวานนท์์นนทบุุรีี11000 โทร. 0-2951-0000 โทรสาร 0-2951-1297 พิิมพ์์ที่่� บริิษััท ธนอรุุณการพิิมพ์์ จำกััด 457/6-7 ถนนพระสุุเมรุุ แขวงบวรนิิเวศ เขตพระนคร กรุุงเทพฯ 10200 โทร. 0-2282-6033-4

วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Vol. 64 No. 2 April- June 2022 ระบาดวิิทยาของเชื้้�อไวรััส SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์เบต้้า (B.1.351) และปััจจััยเสี่่ยง 81 ต่่อการเกิิดอาการรุุนแรง ในภาคใต้้ตอนล่่างของประเทศไทย ช่่วงเมษายน-กัันยายน 2564 สวรรยา จัันทููตานนท์์ และ ชููพงศ์์ แสงสว่่าง การคััดกรองฤทธิ์์�ต้้าน SARS-CoV-2 และโมเลกุุลเป้้าหมายการออกฤทธิ์์�ของพืืชสมุุนไพรไทย 93 ศรายุุธ ระดาพงษ์์ ตีีญานีี สาหััด ณฐภััทร หาญกิิจ พราว ศุุภจริิยาวััตร พิิไลลัักษณ์์ อััคคไพบููลย์์ โอกาดะ วัันดีี มีีฉลาด พรชััย สิินเจริิญโภไคย สมจิิตร์์ เนีียมสกุุล เสกรชตกร บััวเบา ศัักดิ์์�วิิชััย อ่่อนทอง Kenneth J. Ritchie และ ศิิริิวรรณ ชััยสมบููรณ์์พัันธ์์ การพััฒนาและทดสอบความถููกต้้องของวิิธีีวิิเคราะห์์สารตกค้้างคลอร์์มีีควอต ไดควอต 106 เมพิิควอต และพาราควอต ในผัักและผลไม้้โดยเทคนิิค LC-MS/MS เสาวณีีย์์ วาจาสิิทธิ์์� สุุวิิมล หมวดหม๊๊ะ อััจฉรีี อิินแก้้ว กััญญารััตน์์ เชื้ ้� อกููลชาติิ วิิทวััส วัังแก้้วหิิรััญ สกุุลรััตน์์ สมสัันติิสุุข และ ทองสุุข ปายะนัันทน์์ การประเมิินคุุณภาพสารมาตรฐาน Factor VIII แบบผงแห้้งเพื่่อทดสอบค่่าความแรง 121 โสมมริิสา พวงพรศรีี อััศจรรย์์ อาเมน ปััทมา บุุนนาค ฐิิตาภรณ์์ ภููติิภิิณโยวััฒน์์ ชาญวิิทย์์ ชููแก้้ว และ ไพศาล พัังจุุนัันท์์ การพััฒนากระบวนการเตรีียม DMSc Stem Pro:Autologous Bone Marrow 133 Mesenchymal Stem Cells สำหรัับการศึึกษาวิิจััยทางคลิินิิก อััจฉราพร ดำบััว สิิริิภากร แสงกิิจพร ละอองศรีี อััชชะนีียะสกุุล อารีีรััตน์์ ขอไชย อดิิศัักดิ์์� ตรีีนวรััตน์์ สาวิิตรีี ด้้วงเรืือง ศุุภลัักษณ์์ บััวศรีีแก้้ว อภิิชาติิ โชติิชููศรีี พััชราภรณ์์ บุุญชูู ชลลดา ยอดทััพ พััชราภรณ์์ นพปรางค์์ ปััญญกมล จัันทรสาขา และ สมชาย แสงกิิจพร สารบััญ หน้้า นิิพนธ์ ์ ต้้นฉบัับ

วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Vol. 64 No. 2 April- June 2022 CONTENTS Page Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors 81 for Severe Illness in the Southernmost Provinces of Thailand, April-September 2021 Sawanya Chantutanon and Choopong Sangsawang Anti-SARS-CoV-2 Activity Screening of the Selected Thai Medicinal 93 Plants and Potential Host-target Molecules Sarayut Radapong, Tiyanee Sahad, Nathaphat Harnkit, Praw Suppajariyawat, Pilailuk Akkpaiboon Okada, Wandee Meechalad, Pornchai Sincharoenpokai, Somchit Niumsakul, Sekrachatakorn Buaboa, Sakwichai Ontong, Kenneth J. Ritchie, and Siriwan Chaisomboonpan Method Development and Validation of Chlormequat, Diquat, Mepiquat, 106 and Paraquat Residue Determination in Vegetables and Fruits by LC-MS/MS Technique Saovanee Wajasit, Suwimol Muadmah, Atcharee Inkaew, Kanyarat Chuakunchat, Witthawat Wangkaewhiran, Sakulrat Somsuntisuk, and Thongsuk Payanan Evaluation of Factor VIII Freeze-Dried Reference Standard for 121 Potency Testing Soammarisa Paungpornsri, Assajun Amen, Pattama Bunnag, Titaporn Pootipinyowat, Chanwit Chukaeo, and Paisan Pangjunan Manufacturing Process Development of DMSc Stem Pro: Autologous 133 Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Clinical Research Acharaporn Dambua, Siripakorn Sangkitporn, La-ongsri Atchaneeyasakul, Areerat Khorchai, Adisak Trinavarat, Sawitree Duangrueng, Suppaluk Buasrikeaw, Apichat Chotichusree, Patcharaporn Boonchu, Chonlada Yodtup, Phatcharaphon Nopprang, Panyakamol Chandrasakha, and Somchai Sangkitporn Original Articles

บรรณาธิการแถลง วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทยฉบับที่ 2 ปที่ 64 พุทธศักราช 2565 ในฉบับนี้ยังคงมีเนื้อหาบทความ วิชาการที่ใหความรูและนาสนใจหลายเรื่อง ไดแก ระบาดวิทยาของเชื้อไวรัส SARS-CoV-2 สายพันธุเบตา (B.1.351) และปจจัยเสี่ยงตอการเกิดอาการรุนแรง ในภาคใตตอนลางของประเทศไทย ชวงเมษายน-กันยายน 2564, การคัดกรอง ฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุลเปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย, การพัฒนาและทดสอบความถูกตอง ของวิธีวิเคราะหสารตกคางคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในผักและผลไมโดยเทคนิค LC-MS/MS, การประเมินคุณภาพสารมาตรฐาน Factor VIII แบบผงแหงเพื่อทดสอบคาความแรง และการพัฒนากระบวนการเตรียม DMSc Stem Pro: Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells สำหรับการศึกษาวิจัยทางคลินิก กองบรรณาธิการวารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ขอขอบคุณผูนิพนธทุกทานที่สงบทความมาใหพิจารณา ตีพิมพเผยแพรองคความรูและงานวิจัย ซึ่งจะเปนประโยชนตอการปฏิบัติงานดานการพัฒนาวิทยาศาสตรการแพทยและ สาธารณสุขของประเทศ ขอขอบพระคุณผูทรงคุณวุฒิทุกทานในการพิจารณาบทความ (peer review) ที่ใหขอเสนอแนะ ในการปรับปรุงแกไขบทความวิจัยตางๆ ใหมีความถูกตองทางวิชาการและอานไดเขาใจงายขึ้น และขอขอบพระคุณทุกทาน ที่มีสวนในการจัดทำวารสารฉบับนี้ใหเสร็จสมบูรณดวยดี กองบรรณาธิการหวังเปนอยางยิ่งวาวารสารฉบับนี้จะเปนประโยชน สำหรับผูอานทุกทานในการเสริมสรางองคความรูทางดานวิทยาศาสตรการแพทยและสาธารณสุข และโปรดติดตามความรู และงานวิจัยจากวารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทยฉบับตอไป ซึ่งจะเผยแพรภายในเดือนกันยายน 2565 ดร.อภิวัฏ ธวัชสิน บรรณาธิการวารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย คำแนะนำสำหรับผูนิพนธ

นิพนธ์ต้นฉบับ ว กรมวิทย พ 2565; 64 (2): 81-92 81 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 สวรรยา จัันทููตานนท์์ 1 และ ชููพงศ์์ แสงสว่่าง2 1 สำนัักงานป้้องกัันควบคุุมโรคที่่� 12 สงขลา สงขลา 90000 2 ศููนย์์ฝึึกอบรมนัักระบาดวิิทยาภาคสนาม (FETC) สำนัักงานป้้องกัันควบคุุมโรคที่่� 12 สงขลา สงขลา 90000 ระบาดวิท ิ ยาของเชื้้�อไวรััส SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์เบต้้า (B.1.351) และปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรง ในภาคใต้้ตอนล่่างของประเทศไทย ช่่วงเมษายน-กัันยายน 2564 Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 3 February 2022 Revised: 11 May 2022 Accepted: 17 May 2022 บทคัดย่อ การวิจัยนี้เป็นการศึกษาทางระบาดวิทยาของโรคโควิด 19 สายพันธุ์เบต้าที่ระบาดใน 7 จังหวัดภาคใต้ตอนล่าง ของประเทศไทย เป็นการศึกษาแบบภาคตัดขวางในผู้ป่วยยืนยันสายพันธุ์เบต้า โดยทบทวนข้อมูลเฝ้าระวังและ รายงานสอบสวนโรค ของสำ นักงานป้องกันควบคุมโรคที่ 12 สงขลา ระหว่างวันที่ 1 เมษายน-30 กันยายน 2564 พบว่า ผู้ป่วยยืนยันสายพันธุ์เบต้า 551 ราย (ร้อยละ 18.93) จากผู้ป่วยยืนยันที่ทราบสายพันธุ์ 2,911 ราย จังหวัดที่พบสัดส่วน สายพันธุ์เบต้าสูงสุด ได้แก่ นราธิวาส สตูล และปัตตานี (ร้อยละ 50.78, 34.13 และ 13.66 ตามลำ ดับ) เพศชาย 294 ราย หญิง 217 ราย อายุระหว่าง 1-100 ปี (มัธยฐาน 34 ปี) เชื้อชาติไทยร้อยละ 99.27 นับถือศาสนาอิสลามร้อยละ 96 พบผู้ป่วยยืนยันกลุ่มแรกในเดือนพฤษภาคม ระบาดสูงสุดในเดือนกรกฎาคม ปัจจัยเสี่ยงสำ คัญ คือ กิจกรรมรวมกลุ่ม ทางศาสนาอิสลาม และศึกษาเชิงวิเคราะห์แบบ retrospective cohort study ค้นหาปัจจัยเสี่ยงต่อการเกิด อาการรุนแรงของโรคหรือเสียชีวิต ทบทวนเวชระเบียนผู้ป่วยยืนยันสายพันธุ์เบต้าที่เข้ารักษาในโรงพยาบาลของรัฐ จังหวัดนราธิวาสและสตูล ระหว่างวันที่ 1 เมษายน–30 กันยายน 2564 ผู้ป่วยทั้งหมด 286 ราย มีอาการรุนแรง หรือเสียชีวิต 14 ราย ปัจจัยที่สัมพันธ์กับอาการรุนแรงหรือเสียชีวิต ได้แก่ ผู้ที่อายุ ≥ 60 ปี (adjusted OR = 11.26, 95% CI: 2.42-52.59) ผู้ที่มีโรคประจำ ตัวเรื้อรัง (adjusted OR = 23.80, 95%CI: 1.23-458.61) และเพศชาย (adjusted OR = 7.36, 95%CI: 1.02-52.76) การระบาดเชื้อสายพันธุ์เบต้าในภาคใต้ตอนล่างเกี่ยวข้องกับ การลักลอบเข้าประเทศและกิจกรรมรวมกลุ่มทางศาสนาอิสลาม ควรเพิ่มมาตรการเฝ้าระวังพื้นที่ชายแดน เน้นมาตรการป้องกันควบคุมโรคในกลุ่มหลบหนีเข้าเมือง งดกิจกรรมการร่วมกลุ่มทางศาสนา และความครอบคลุม การให้วัคซีนในผู้สูงอายุและผู้มีโรคเรื้อรัง คำ สำ คัญ : โรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019, สายพันธุ์เบต้า, ปัจจัยเสี่ยงต่ออาการรุนแรงของโรค, ภาคใต้ตอนล่าง

Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors for Severe Illness Sawanya Chantutanon and Choopong Sangsawang 82 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 บทนำ โรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 (Coronavirus disease 2019 หรืือ COVID-19) เกิิดจากการติิดเชื้้อ ไวรััสโคโรนาใน Family Coronaviridae มีีระยะฟัักตััว เฉลี่่ย 5-6 วััน ถึึง 14 วััน สามารถแพร่่กระจายเชื้้อจาก คนสู่่คนโดยการสััมผััส กัับสารคััดหลั่่งจากทางเดิินหายใจ หรืือแพร่่กระจายเชื้้อของฝอยละอองน้้ำมููก น้้ำลาย จากผู้้ป่่วยที่่มีีเชื้้อโดยการไอหรืือจาม ผู้้ที่่ติิดเชื้้อส่่วนใหญ่่ ไม่่แสดงอาการร้้อยละ 45 และหากมีีอาการมัักจะแสดง อาการเล็็กน้้อยเท่่านั้้น เช่่น ไข้้ ไอ น้้ำมููก สููญเสีียการได้้กลิ่่น การรัับรส เป็็นต้้น เพีียงร้้อยละ 10 ที่่มีีอาการรุุนแรงตั้้งแต่่ เกิิดภาวะปอดอัักเสบ (pneumonia) จนทำให้้เสีียชีวิีิตได้้ โดยกลุ่่มเสี่่ยงที่่พบจะมีีภาวะปอดอัักเสบรุุนแรงจนเสีียชีวิีิต ได้้แก่่ กลุ่่มผู้้สููงอายุุ ผู้้มีีโรคประจำตััว เช่่น โรคเบาหวาน ความดัันโลหิิตสููง โรคระบบทางเดิินหายใจเรื้้อรััง และ ผู้้ที่่มีีภููมิิคุ้้มกัันบกพร่่อง(1) ปััจจุุบัันมีีหลายวิิธีีในการ ตรวจหาเชื้้อ SARS-CoV-2 เพื่่อวินิิจฉััยโรคติิดเชื้้อไวรััส โคโรนา 2019 แต่่วิิธีีมาตรฐานที่่ยอมรัับที่่สุุดในปััจจุุบััน โดยศููนย์์ควบคุุมและป้้องกัันโรคแห่่งสหรััฐอเมริิกา (US CDC) และองค์์การอนามััยโลก คืือ Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)(2) พบผู้้ป่่วยรายแรกด้้วยโรคปอดอัักเสบ ไม่่ทราบสาเหตุุ จากเมืืองอู่่ฮั่ ่น (Wuhan) มณฑลหููเป่่ย (Hubei) สาธารณรััฐประชาชนจีีน เมื่่อปลายเดืือนธัันวาคม 2562 ต่่อมาในเดืือนมกราคม 2563 ศููนย์์ควบคุุม และป้้องกัันโรคแห่่งสาธารณรััฐประชาชนจีีน (Chinese Center for Disease Control and Prevention; China CDC) ได้้ประกาศอย่่างเป็็นทางการถึึงสาเหตุุ ของโรคปอดอัักเสบดัังกล่่าวเกิิดจากเชื้้อไวรััสโคโรนา ชนิิดใหม่่ หลัังจากนั้้น The International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) ประกาศ ชื่่อใหม่่ของไวรััสเป็็นไวรััสซาร์์ส-โควีี-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2; SARS-CoV-2) และในเดืือนถััดมาจึึงตั้้งชื่่อโรคที่่เกิิดจาก การติิดเชื้้อไวรััสดัังกล่่าว เป็็นโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 หรืือโรคโควิิด 19 (Coronavirus disease 2019; COVID-19)(3) การระบาดของโรคโควิิด 19 ได้้กระจาย เป็็นวงกว้้างอย่่างรวดเร็็ว จากเริ่่มแรกมีีการระบาดใน สาธารณรััฐประชาชนจีีนเพีียงประเทศเดีียว ต่่อมาได้้ กระจายไปยัังประเทศและภููมิิภาคอื่่นๆ ทั่่วโลก โดย ในวัันที่่ 11 มีีนาคม 2563 องค์์การอนามััยโลก จึึงได้้ ประกาศให้้โรคโควิิด 19 เป็็นโรคระบาดใหญ่่ทั่่วโลก (pandemic)(4) ประเทศไทยเริ่่มพบผู้้ป่่วยโรคโควิิด 19 รายแรกเป็็นนัักท่่องเที่่ยวหญิิงชาวจีีน อายุุ 61 ปีี เข้้ามา ในประเทศไทย เมื่่อเดืือนมกราคม 2563(5) นัับแต่่นั้้นมา จึึงเริ่่มมีีการระบาดภายในประเทศ องค์์การอนามััยโลก ร่่วมมืือกัับพัันธมิิตรนานาชาติิ เครืือข่่ายผู้้เชี่่ยวชาญ และนัักวิิจััยของหน่่วยงานต่่างๆ ทั่่วโลก ติิดตามและประเมิินวิิวััฒนาการของเชื้้อไวรััส SARS-CoV-2 ตั้้งแต่่เดืือนมกราคม 2563 ถึึงช่่วง ปลายปีี 2563 เกิิดโควิิดหลากหลายสายพัันธุ์์ซึ่่งองค์์การ อนามััยโลกได้ตั้้ ้งชื่่อ และกำหนดสายพัันธุ์์ต่่างๆ เป็็น 2 กลุ่่ม คืือ สายพัันธุ์์ที่่น่่าวิิตก (Variants of Concer: VOC) และสายพัันธุ์์ที่่ต้้องเฝ้้าระวััง (Variants of Interest: VOI) สายพัันธุ์์กลุ่่ม VOC จะก่่อให้้เกิิดการแพร่่ระบาดในวงกว้้าง ได้้อย่่างรวดเร็็วและรุุนแรง ลดภูมิู คุ้้ ิมกัันและประสิิทธิิภาพ วััคซีีน ได้้แก่่ 1) สายพัันธุ์์ Alpha (B.1.1.7) พบครั้้งแรก ในประเทศอัังกฤษ 2) สายพัันธุ์์ Beta (B.1.351) พบครั้้งแรกในประเทศแอฟริิกาใต้้ ทั้้งสองสายพัันธุ์์ เริ่่มมีีการแพร่่ระบาดเมื่่อเดืือนกัันยายน 2563 3) สายพัันธุ์์ Delta (B.1.617.2) เป็็นการกลายพัันธุ์์ของสายพัันธุ์์ อิินเดีีย (B.1.617.1) ต่่อมาแพร่่ระบาดอย่่างรวดเร็็ว ไปหลายประเทศ ได้้แก่่ อเมริิกา อัังกฤษ ตุุรกีี ในเดืือน มีีนาคม 2564 และขยายไปทั่่วโลก 4) สายพัันธุ์์ Gamma (P.1) พบครั้้งแรกในประเทศบราซิิล(6-9) สำหรัับ ประเทศไทยพบผู้้ติิดเชื้้อโรคโควิิด 19 สายพัันธุ์์กลุ่่ม VOC ได้้แก่่ สายพัันธุ์์อััลฟา (Alpha) เริ่่มระบาดในช่่วงเดืือน เมษายน 2564 สายพัันธุ์์เบต้้า (Beta) พบรายแรกเป็็นผู้้เดิิน ทางมาจากประเทศแทนซาเนีีย และสายพัันธุ์์เดลต้้า (Delta) เริ่่มพบการระบาดในเดืือนพฤษภาคม 2564 ระหว่่างเดืือนเมษายน-กัันยายน 2564 พบการ ระบาดของสายพัันธุ์์เบต้้า ในประเทศไทยใน 4 จัังหวััด ภาคใต้้ตอนล่่าง ได้้แก่่ นราธิิวาส สตููล ยะลา และ ปััตตานีี จากข้้อมููลการเฝ้้าระวัังการกลายพัันธุ์์ของเชื้้อโรค โควิิด 19 ในพื้้นที่่เขตสุุขภาพที่่ 12 พบว่่าเริ่่มมีีการ

ระบาดวิิทยาของเชื้้�อไวรััส SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์�เบต้้า (B.1.351) และปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรง สวรรยา จัันทููตานนท์์ และ ชููพงศ์์ แสงสว่่าง 83 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 ระบาดของสายพัันธุ์์เบต้้า ในคลััสเตอร์์ตำบลเกาะ สะท้้อน อำเภอตากใบ จัังหวััดนราธิิวาส พบผู้้ติิดเชื้้อ รายแรกมีีประวััติิเดิินทางมาจากประเทศมาเลเซีีย ในช่่วง 14 วัันก่่อนมีีอาการ โดยการลัักลอบเข้้าออก ผ่่านช่่องทางธรรมชาติิจึึงไม่่ได้้รัับการกัักกัันและคััดกรอง ตามแนวทางปกติิ ต่่อมาเริ่่มแพร่่ระบาดไปยัังจัังหวััด ใกล้้เคีียง ซึ่่งส่่วนใหญ่่มีีความเชื่่อมโยงกัับคลััสเตอร์์ อำเภอตากใบ แต่่ไม่่พบการแพร่่ระบาดในภููมิิภาคอื่่นๆ ในประเทศ จึึงมีีความสนใจในการศึึกษาระบาดวิิทยา โรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้าที่่ระบาด ในภาคใต้้ตอนล่่าง โดยมีวัีัตถุุประสงค์์เพื่่ออธิิบายลัักษณะ การระบาดของโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์ เบต้้าในพื้้นที่่ภาคใต้้ตอนล่่าง ความรุุนแรงของโรคและ ค้้นหาปััจจััยเสี่่ยงต่่อการเกิิดโรครุุนแรงหรืือเสีียชีีวิิต วัสดุและวิธีการ การศึึกษาระบาดวิทิยาของไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า ใน 7 จัังหวััด ภาคใต้้ตอนล่่าง (สงขลา สตููล พัทลุุ ั ง ตรััง ปััตตานีี ยะลา และนราธิิวาส) ดำเนิินการศึึกษาแบบภาคตััดขวาง (crosssectional study) โดยรวบรวมข้้อมููลทุุติิยภููมิิจากฐาน ข้้อมููลเฝ้้าระวัังสายพัันธุ์์โรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 ของสำนัักงานป้้องกัันควบคุุมโรคที่่ 12 สงขลา ทบทวน รายงานสอบสวนโรคตามแบบฟอร์์ม Novelcorona 2 กรมควบคุุมโรค รายงานสอบสวนการระบาดของผู้้ติิดเชื้้อ ไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า และข้้อมููลรายงาน ผลการตรวจสายพัันธุ์์ของเชื้้อ SARS-CoV-2 ด้้วย วิิธีี MassARRAY จากศููนย์์จีีโนมทางการแพทย์์ คณะ แพทยศาสตร์์ โรงพยาบาลรามาธิิบดีี และผลวิิเคราะห์์ รหััสพัันธุุกรรมแบบ whole genome sequencing จากกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กระทรวงสาธารณสุุข ประชากรศึึกษา ได้้แก่่ ผู้้ติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 ที่่พบสารพัันธุุกรรมของเชื้้อ SARS-CoV-2 ด้้วยวิิธีี RT-PCR และยืืนยัันพบสายพัันธุ์์ของเชื้้อด้้วยวิิธีี MassARRAY และ whole genome sequencing ที่่เข้้ารัับการรัักษาในหน่่วยบริิการในพื้้นที่่ 7 จัังหวััดภาคใต้้ ตอนล่่าง ได้้แก่่ สงขลา ปััตตานีี ยะลา นราธิิวาส สตููล พััทลุุง และตรััง และรายงานเข้้าฐานข้้อมููลเฝ้้าระวััง สายพัันธุ์์โรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สำนัักงานป้้องกััน ควบคุุมโรคที่่ 12 สงขลา ระหว่่างวัันที่่ 1 เมษายน30 กัันยายน 2564 โดยมีนิีิยามผู้้ติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์อััลฟา เบต้้า และเดลต้้า หมายถึึง ประชากร ศึึกษาที่่ยืืนยัันพบเชื้้อ SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์อััลฟา (B.1.1.7) สายพัันธุ์์เบต้้า (B.1.351) และสายพัันธุ์์เดลต้้า (B.1.617.2) การรวบรวมและวิิเคราะห์์ข้้อมููล ตััวแปรที่่ เก็็บรวบรวม ได้้แก่่ เพศ อายุุ สััญชาติิ จัังหวััดที่่รัักษา วััน ที่่เก็็บตััวอย่่าง วัันที่่รายงานผล ผลการรัักษา วิิเคราะห์์ ข้้อมููลการกระจายของโรคตามบุุคคล เวลา สถานที่่ โดยใช้้โปรแกรม excel นํําเสนอผลในรููปแบบร้้อยละ ค่่ามััธยฐาน และค่่าพิิสััย การวิิเคราะห์์ปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรงของโรค ติิดเชื้้�อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า ดำเนิินการศึึกษาแบบ retrospective cohort study ในผู้้ติิดเชื้้อ SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์เบต้้า ที่่เข้้ารัักษาในโรงพยาบาลของรััฐจัังหวััดนราธิิวาสและ จัังหวััดสตููล ระหว่่างวัันที่่ 1 เมษายน-30 กัันยายน 2564 กำหนดพื้้นที่่ศึึกษา ได้้แก่่ โรงพยาบาลทั่่วไป 2 แห่่ง และโรงพยาบาลชุุมชน 6 แห่่ง มีีจำนวนผู้้ติิดเชื้้อรวม 375 ราย รวบรวมข้้อมููลโดยทบทวนเวชระเบีียนผู้้ป่่วย ทบทวนรายงานสอบสวนผู้้ป่่วยตามแบบฟอร์์ม Novelcorona 2 กรมควบคุุมโรค และข้้อมููลรายงาน ผลการตรวจสายพัันธุ์์ของเชื้้อ SARS-CoV-2 ด้้วยวิิธีี gene sequencing จากศููนย์์จีีโนมทางการแพทย์์ คณะแพทยศาสตร์์ โรงพยาบาลรามาธิิบดีี และ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ เก็็บข้้อมููลสำคััญ ได้้แก่่ ข้้อมููลลัักษณะบุุคคล ประวััติิโรคประจำตััว ประวััติิการรัับ วััคซีีนโควิิด 19 ข้้อมููลทางคลิินิิกแรกรัับ และหลััง เข้้ารัับการรัักษา อััตราการหายใจ การตรวจวััดค่่า oxygen saturation (O2 sat) ผลตรวจ chest x-ray ภาวะ แทรกซ้้อนและการรัักษา ปััจจััยที่่นำมาศึึกษาเชิิงวิิเคราะห์์ ได้้แก่่ เพศ อายุุ โรคประจำตััวเรื้้อรััง ดััชนีีมวลกาย (Body mass index: BMI) การตั้้งครรภ์์ การรัับ วััคซีีนโควิิด 19 ผลลััพธ์์ที่่สนใจ คืือ ความรุุนแรงของโรค โดยกำหนดนิิยามโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนาที่่มีีอาการไม่รุ่ ุนแรง

Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors for Severe Illness Sawanya Chantutanon and Choopong Sangsawang 84 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 ได้้แก่่ 1) ผู้้ติิดเชื้้อไม่่แสดงอาการ (asymptomatic infection) คืือ ผู้้ติิดเชื้้อยืืนยัันที่่ไม่มี่ ีอาการ และผลตรวจ เอกซเรย์์ปอด (CXR) ปกติิ 2) ผู้้ติิดเชื้้ออาการเล็็กน้้อย (mild illness) คืือ ผู้้ติิดเชื้้อยืืนยัันที่่มีีอาการข้้อใดข้้อหนึ่่ง ได้้แก่่ ไข้้ ไอ เจ็็บคอ น้้ำมููก ลิ้้นไม่่รัับรส จมููกไม่่ได้้กลิ่่น มีีผื่่น หรืือถ่่ายเหลว ร่่วมกัับไม่่มีีอาการหอบเหนื่่อย และไม่่มีีปอดอัักเสบจากผลตรวจเอกซเรย์์ปอด และ 3) ผู้้ติิดเชื้้ออาการปานกลาง (moderate illness) ได้้แก่่ ปอดอัักเสบ และค่่า room air O2 sat > 93% นิิยามโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนาที่่มีีอาการรุุนแรง (severe or critical illness) คืือ ผู้้ติิดเชื้้อที่่มีีอาการข้้อใดข้้อหนึ่่ง ได้้แก่่ อััตราหายใจ > 30 ครั้้ง/นาทีี, ค่่า room air O2sat ≤ 93% พบรอยโรคในปอด > 50% ภาวะหายใจล้้มเหลว อวััยวะล้้มเหลว หรืือเสีียชีีวิิต การวิิเคราะห์์หาขนาดความ สััมพัันธ์์ระหว่่างการสััมผััสปััจจััยและการเกิิดโรครุุนแรง โดยเปรีียบเทีียบสััดส่่วนการเกิิดโรครุุนแรงในผู้้สััมผััส และไม่่สััมผััสปััจจััยใช้้สถิิติิ chi-square โดยนำตััวแปร ที่่มีีค่่า p-value < 0.20 จาก univariate analysis มาวิิเคราะห์์ด้้วยวิิธีี multiple logistic regression คำนวณค่่า adjusted odd ratio (OR) ที่่ค่่าความ เชื่่อมั่่นร้้อยละ 95 ผล การระบาดของโรคติิดเชื้้�อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์ เบต้้า ใน 7 จัังหวััด ภาคใต้้ตอนล่่าง ระหว่่าง 1 เมษายน - 30 กัันยายน 2564 ขนาดปััญหาและการกระจายของโรคตามเวลา วัันที่่ 1 เมษายน-30 กัันยายน 2564 มีีผู้้ติิดเชื้้อทั้้งหมด 114,204 ราย ส่่งตรวจยืืนยัันสายพัันธุ์์ได้้ทั้้งหมด 2,911 ราย (ร้้อยละ 2.55) เป็็นเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์อััลฟา 1,343 ราย เดลต้้า 1,017 ราย และเบต้้า 551 ราย คิิดเป็็นร้้อยละ 46.14, 34.94 และ 18.93 ตามลำดัับ ดัังแสดงในภาพที่่ 1 รายงานผู้้ติิดเชื้้อสายพัันธุ์์อััลฟา เป็็นกลุ่่มแรกที่่อำเภอหาดใหญ่่ จัังหวััดสงขลา ส่่วนใหญ่่ มีีประวัติัิเดิินทางมาจากกรุุงเทพ สำหรัับผู้้ติิดเชื้้อสายพัันธุ์์ เบต้้าพบรายแรกในเดืือนพฤษภาคม 2564 สััดส่่วน การพบเชื้้อสายพัันธุ์์เบต้้าสููงสุุดช่่วงเดืือนมิิถุุนายนกรกฎาคม 2564 และมีีแนวโน้้มลดลงในเดืือน กัันยายน 2564 พร้้อมๆ กัับการเพิ่่มสููงขึ้้นของการระบาด ของเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เดลต้้า ดัังแสดง ในภาพที่่ 2 มีีรายงานผู้้ติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์ เบต้้ากระจายไปในพื้้นที่่ 7 จัังหวััดภาคใต้้ตอนล่่าง จัังหวััดที่่พบสััดส่่วนการติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้าจากทุุกสายพัันธุ์์ในแต่่ละจัังหวััดสููงสุุด 3 ลำดัับแรก ได้้แก่่ นราธิิวาส สตููล และปััตตานีี คิิดเป็็นร้้อยละ 50.78, 34.13 และ 13.66 ตามลำดัับ ดัังแสดงในภาพที่่ 3 ผู้้ติิดเชื้้อยืืนยัันสายพัันธุ์์เบต้้า 551 ราย เป็็นเพศชาย 294 ราย เพศหญิิง 217 ราย อายุุระหว่่าง 1-100 ปีี (มััธยฐานอายุุ 34 ปีี) เชื้้อชาติิไทย ร้้อยละ 99.27 (547 ราย) และนัับถืือศาสนาอิิสลามร้้อยละ 96 จาก การวิิเคราะห์์ข้้อมููลรายงานการสอบสวนโรคของ ทีีมสอบสวนโรค สำนัักงานป้้องกัันควบคุุมโรคที่่ 12 จัังหวััดสงขลา พบว่่ามีีการระบาดของผู้้ติิดเชื้้อ ไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้าที่่เป็็นคลััสเตอร์์ ขนาดใหญ่่ 2 เหตุุการณ์์ ได้้แก่่ 1) การระบาดกลุ่่มก้้อนแรก ที่่อำเภอตากใบ จัังหวััดนราธิิวาส เริ่่มมีีรายงานตั้้งแต่วั่ ันที่่ 26 เมษายน-23 พฤษภาคม 2564 มีีรายงานผู้้ติิดเชื้้อ จำนวน 364 ราย ส่่งตรวจยืืนยัันสายพัันธุ์์พบเป็็นสาย พัันธุ์์เบต้้าจำนวน 85 ราย อััตราส่่วนเพศชายต่่อหญิิง เท่่ากัับ 1:1 (43/42) อายุุระหว่่าง 10 เดืือน-86 ปีี (มััธยฐาน 29 ปีี) ผลการสอบสวนพบว่่าผู้้ป่่วยรายแรก เป็็นเพศชายอายุุ 32 ปีี ทำธุุรกิิจส่่วนตััว เริ่่มมีีไข้้ ปวดกล้้ามเนื้้อวัันที่่ 26 เมษายน 2564 เข้้ารัับการรัักษา ที่่โรงพยาบาลชุุมชนแห่่งหนึ่่งวัันที่่ 30 เมษายน 2564 และไปตรวจยืืนยัันพบเชื้้อที่่โรงพยาบาลเอกชนวัันที่่ 4 พฤษภาคม 2564 ระยะ 14 วััน ก่่อนป่่วยมีีประวัติัิเดิินทาง ข้้ามชายแดนไทย-มาเลเซีีย ผ่่านช่่องทางธรรมชาติิ การค้้นหาผู้้ป่่วยเพิ่่มเติิมด้้วยวิิธีี contact tracing พบอััตราการติิดเชื้้อในผู้้สััมผััสเสี่่ยงสููงร้้อยละ 11.8 (81/683) และอััตราการติิดเชื้้อในผู้้สััมผััสเสี่่ยงต่่ำ ร้้อยละ 1.9 (3/160) กิิจกรรมเสี่่ยงสำคััญ ได้้แก่่ การสััมผััส ในครอบครััว การเยี่่ยมผู้้ป่่วย และกิิจกรรมการรวมกลุ่่ม วัันงานพิิธีีทางศาสนา (เทศกาลฮารีีรายอ) เมื่่อวัันที่่ 13 พฤษภาคม 2564 2) เหตุุการณ์์การระบาดเป็็นกลุ่่มก้้อน ในโรงเรีียนสอนศาสนาแห่่งหนึ่่ง ซึ่่งตั้้งอยู่่ในศููนย์์มััรกััส ยะลา อำเภอเมืือง จัังหวััดยะลา เกิิดการแพร่่กระจาย กว้้างขวางในพื้้นที่่จัังหวััดภาคใต้้ตอนล่่าง พบรายงาน

ระบาดวิิทยาของเชื้้�อไวรััส SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์�เบต้้า (B.1.351) และปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรง สวรรยา จัันทููตานนท์์ และ ชููพงศ์์ แสงสว่่าง 85 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 ผู้้ป่่วยยืืนยัันโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 เมื่่อวัันที่่ 9 มิิถุุนายน 2564 ในกลุ่่มนัักเรีียนประจำชายล้้วนประมาณ 500 คน จาก 17 จัังหวััดทั่่วประเทศ ส่่วนใหญ่่มีีภููมิิลำเนา อยู่่ในจัังหวััดภาคใต้้ตอนล่่าง การระบาดพบในกลุ่่ม นัักเรีียนประจำที่่มาทำกิิจกรรมในโรงเรีียนเพื่่อรอเปิิด ภาคเรีียน จัังหวััดยะลาได้้มีีการเลื่่อนเปิิดภาคเรีียนทำให้้ นัักเรีียนเดิินทางกลัับภููมิิลำเนา และมีีรายงานนัักเรีียน ที่่กลัับไปตรวจพบเชื้้อที่่จัังหวััดภูมิู ิลำเนา ได้้แก่่ นราธิิวาส ปััตตานีี สงขลา สตููล กระบี่่ พััทลุุง นครศรีีธรรมราช สุุราษฎร์์ธานีี พัังงา ตรััง และภููเก็็ต รวมทั้้งมีีกลุ่่มก้้อน การระบาดตามมาในหลายจัังหวััด ผลตรวจเชื้้อหาสาเหตุุ พบทั้้งสายพัันธุ์์อััลฟาและสายพัันธุ์์เบต้้า และพบ ความเชื่่อมโยงกัับแหล่่งระบาดแรกที่่อำเภอตากใบ โดยมีีนัักเรีียนจากอำเภอตากใบมาเข้้าร่่วมกิิจกรรมใน โรงเรีียนหลัังกลัับจากเทศกาลฮารีีรายอ ปััจจััยเสี่่ยง การแพร่่โรคในโรงเรีียน ได้้แก่่ การอยู่่ร่่วมกัันอย่่างแออััด การสััมผััสใกล้้ชิิดระหว่่างทำกิิจกรรมในโรงเรีียน การรัับ ประทานอาหารร่่วมกัันโดยใช้้มืือหยิิบอาหาร การพููดคุุย ระยะน้้อยกว่่า 2 เมตร โดยไม่่สวมหน้้ากากอนามััย เป็็นต้้น ภาพที่่� 1 สััดส่่วนชนิิดสายพัันธุ์์ของเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 ภาคใต้้ตอนล่่าง เดืือนเมษายน–กัันยายน 2564 (n = 2,911) ภาพที่่� 2 สััดส่่วนชนิิดสายพัันธุ์์ของเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 ภาคใต้้ตอนล่่าง เดืือนเมษายน–กัันยายน 2564 (n = 2,911) เม.ย.(n = 66) พ.ค.(n = 110) มิิ.ย.(n = 882) ก.ค.(n = 760) ส.ค (n = 888) ก.ย.(n = 750)

Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors for Severe Illness Sawanya Chantutanon and Choopong Sangsawang 86 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 ปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรงของโรคติิดเชื้้�อ ไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า จากการทบทวนเวชระเบีียนผู้้ติิดเชื้้อ SARSCoV-2 สายพัันธุ์์เบต้้าในพื้้นที่่ศึึกษาจัังหวััดนราธิิวาส และจัังหวััดสตููล จำนวน 286 ราย คิิดเป็็นร้้อยละ 74.93 ของผู้้ติิดเชื้้อยืืนยัันสายพัันธุ์์เบต้้าทั้้งหมด (286/375) เป็็นผู้้ติิดเชื้้ออาการไม่่รุุนแรง 272 ราย จำแนกเป็็น ผู้้ติิดเชื้้อไม่่มีีอาการร้้อยละ 51.05 (146/286) อาการ เล็็กน้้อยร้้อยละ 39.30 (113/286) และอาการปานกลาง ร้้อยละ 6.29 (18/286) เป็็นผู้้ติิดเชื้้ออาการรุุนแรง หรืือวิิกฤติิร้้อยละ 4.90 (14/286) ในจำนวนนี้้เสีียชีีวิิต 6 ราย คิิดเป็็นอััตราป่่วยเสีียชีีวิิตร้้อยละ 2.10 (6/286) ร้้อยละอาการที่่พบมากที่่สุุด ได้้แก่่ ไข้้ ไอ มีีน้้ำมููก จมููกไม่่ได้้กลิ่่น และปวดศีีรษะ ดัังแสดงในภาพที่่ 4 ผู้้ติิดเชื้้ออาการรุุนแรงส่่วนใหญ่่ไม่่ได้้รัับวััคซีีน (ร้้อยละ 92.86) เป็็นเพศชาย (ร้้อยละ 71.43) อายุุ 60 ปีีขึ้้นไป (ร้้อยละ 64.29) โรคประจำตััวที่่พบสััดส่่วนสููงสุุด คืือ โรคเบาหวานและความดัันโลหิิตสููง (ร้้อยละ 28.57) ระยะเวลาตั้้งแต่่เริ่่มป่่วยจนได้รั้ับยา favipiravir 0-8 วััน (มััธยฐาน 3 วััน) ดัังแสดงในตารางที่่ 1 ผลการวิิเคราะห์์แบบ multivariate analysis พบว่่าปััจจััยที่่เพิ่่มความเสี่่ยง ต่่อการเกิิดโรครุุนแรง ได้้แก่่ ผู้้ที่่มีีอายุุมากกว่่าหรืือเท่่ากัับ 60 ปีี (adjusted OR = 11.26, 95%CI 2.42-52.59) มีีประวััติิเป็็นโรคปอดเรื้้อรััง (adjusted OR = 23.80, 95%CI 1.23-458.61) และเพศชาย (adjusted OR = 7.36, 95%CI 1.02-52.76) ดัังแสดงในตารางที่่ 2 ภาพที่่� 3 สััดส่่วนเชื้้อสายพัันธุ์์เบต้้าจากตััวอย่่างที่่ยืืนยัันสายพัันธุ์์ทั้้งหมดรายจัังหวััดภาคใต้้ตอนล่่าง เดืือนเมษายน– กัันยายน 2564 (n = 551) ภาพที่่� 4 ร้้อยละผู้้ป่่วยโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้าจำแนกตามอาการ จัังหวััดนราธิิวาสและสตููล เดืือนเมษายน–สิิงหาคม 2564 (n = 140)

ระบาดวิิทยาของเชื้้�อไวรััส SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์�เบต้้า (B.1.351) และปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรง สวรรยา จัันทููตานนท์์ และ ชููพงศ์์ แสงสว่่าง 87 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 ตารางที่่� 1 ลัักษณะทางระบาดวิิทยาของผู้้ติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า จัังหวััดนราธิิวาสและสตููล เดืือนเมษายน-กัันยายน 2564 (n = 286) เพศ ชาย 146(51.05) 10 (71.43) หญิิง 140(48.95) 4 (28.57) อายุุ <15 ปีี 61(21.33) 0 (0.00) 15-59 ปีี 199(69.58) 5 (35.71) ≥ 60 ปีี 26(9.09) 9 (64.29) โรคเรื้้อรััง เบาหวาน 11(3.85) 4 (28.57) โรคหััวใจ 6(2.10) 1 (7.14) ไตวายเรื้้อรััง 3(1.05) 2 (14.29) โรคปอดเรื้้อรััง 4(1.40) 2 (14.29) หลอดเลืือดสมอง 3(1.05) 2 (14.29) ความดัันโลหิิตสููง 22(7.69) 4 (28.57) BMI ≥ 30 212(74.13) 8 (57.14) <30 22(7.69) 1 (7.14) ไม่่ทราบ 52(18.18) 5 (35.72) ตั้้งครรภ์์ ใช่่ 2(0.70) 0 (0.00) ไมใช่่ 284(99.30) 14 (100.00) วััคซีีนโควิิด 19 ไม่่ได้้รัับ 280(97.90) 13 (92.86) 1 เข็็ม/2 เข็็มไม่่ถึึง 14 วััน 4(1.40) 1 (7.14) 2 เข็็มเกิิน 14 วััน 2(0.70) 0 (0.00) Favipiravir ได้้รัับ 3(11.19) 8 (57.14) ไม่่ได้้รัับ 254(88.81) 6 (42.86) Dexamethaxone ได้้รัับ 13(4.92) 8 (57.14) ไม่่ได้้รัับ 251(95.08) 6 (42.86) วัันพบเชื้้อถึึงรัับยา Favipiravir (มััธยฐาน/พิิสััย) 3 วััน (0-10 วััน) 3 วััน (0-8 วััน) วัันพบเชื้้อถึึงรัับยา Dexamethaxone (มััธยฐาน/พิิสััย) 2 วััน (0-9 วััน) 3 วััน (0-8 วััน) ปััจจััย จำนวนทั้้�งหมด (n = 286) อาการรุุนแรง (n = 14)

Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors for Severe Illness Sawanya Chantutanon and Choopong Sangsawang 88 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 ตารางที่่� 2 ปััจจััยเสี่่ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรงของโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า จัังหวััดนราธิิวาส และสตููล เดืือนเมษายน-กัันยายน 2564 (n = 286) หมายเหตุุ *หมายถึึง มีีนััยสำคััญทางสถิิติิที่่ p-value < 0.05, †วิิเคราะห์์ multivariate analysis เฉพาะตััวแปร ที่่p-value <0.2 จาก univariate analysis ปััจจััย อาการรุุนแรง อาการไม่่รุุนแรง Crude RR (95%CI) Adjusted OR (95%CI)† เพศ หญิิง 4 136 1 1 ชาย 10 136 2.40(0.77-7.47) 7.36(1.02-52.76)* อายุุ < 60 ปีี 5 255 1 1 ≥ 60 ปีี 9 17 18.00(6.51-49.73)* 11.26(2.42-52.59)* โรคเบาหวาน ไม่่มีี 10 265 1 1 มีี 4 7 10.00(3.71-26.93)* 6.12(0.48-78.43) ความดัันโลหิิตสููง ไม่่มีี 10 254 1 1 มีี 4 18 4.8(1.64-14.06)* 1.16(0.15-8.99) โรคหััวใจ ไม่่มีี 13 267 1 1 มีี 1 5 3.59(0.55-23.20) 0.39(0.01-16.20) โรคปอดเรื้้อรััง ไม่่มีี 12 270 1 1 มีี 2 2 11.75(3.81-36.21)* 23.80(1.23-458.61)* โรคหลอดเลืือดสมอง ไม่่มีี 12 271 1 1 มีี 2 1 15.72(5.94-41.60)* 21.95(0.93-518.7) BMI ≥ 30 ไม่่มีี 8 204 1 - มีี 1 21 1.20(0.16-9.19) รัับวััคซีีน ≥ 1 เข็็ม ไม่่ได้้รัับ 13 267 1 - ได้้รัับ 1 5 3.59(0.56-23.20)

ระบาดวิิทยาของเชื้้�อไวรััส SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์�เบต้้า (B.1.351) และปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรง สวรรยา จัันทููตานนท์์ และ ชููพงศ์์ แสงสว่่าง 89 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 วิจารณ์ การระบาดของเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า พบในทั้้ง 7 จัังหวััดภาคใต้้ตอนล่่าง ได้้แก่่ นราธิิวาส สตููล ปััตตานีี ยะลา สงขลา พััทลุุง และตรััง โดยการระบาด เริ่่มต้้นปลายเดืือนเมษายน 2564 ตรวจพบครั้้งแรกเดืือน พฤษภาคม 2564 พบการระบาดสููงสุุดในเดืือนมิถุิุนายน– กรกฎาคม 2564 หลัังจากนั้้นสััดส่่วนการพบเชื้้อแนว โน้้มลดลง สััดส่่วนการพบเชื้้อสะสมของสายพัันธุ์์เบต้้า ในจัังหวััดภาคใต้้ตอนล่่างน้้อยกว่่าสายพัันธุ์์อััลฟาและ เดลต้้า ซึ่่งเป็็นสายพัันธุ์์หลัักของการระบาดระลอก เดืือนเมษายน 2564 ระหว่่างเดืือนเมษายน-กรกฎาคม และเดืือนสิิงหาคม-กัันยายน 2564 ตามลำดัับ สอดคล้้อง กัับข้้อมููลทางวิิชาการที่่พบว่่าความสามารถการแพร่่โรค ของสายพัันธุ์์เบต้้าเพิ่่มขึ้้นจากสายพัันธุ์์ดั้้งเดิิมร้้อยละ 50 ส่่วนสายพัันธุ์์อััลฟาเพิ่่มขึ้้นร้้อยละ 40-80 และเดลต้้า เพิ่่มขึ้้นสููงสุุดร้้อยละ 97 โดยมีค่ี่า reproductive number ของสายพัันธุ์์เดลต้้าระหว่่าง 3.2-8.0 (เฉลี่่ย 5.08)(10-12) จากการศึึกษาครั้้งนี้้พบว่่าผู้้ติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้าส่่วนใหญ่่อาการไม่่รุุนแรง มีีผู้้ติิดเชื้้อไม่่ แสดงอาการร้้อยละ 50 และอััตราป่่วยตายร้้อยละ 2.1 ซึ่่งสอดคล้้องกัับการศึึกษาที่่รายงานว่่าเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้า ไม่่ได้้เพิ่่มความเสี่่ยงต่่อการเสีียชีวิีิต เมื่่อเทีียบกัับสายพัันธุ์์ดั้้งเดิิม(11) ผลการสอบสวนพบแหล่่งโรคแรกของการระบาด สายพัันธุ์์เบต้้า เกิิดจากการนำเชื้้อเข้้าจากประเทศเพื่่อนบ้้าน ซึ่่งพบการระบาดของสายพัันธุ์์ดัังกล่่าวในขณะนั้้น โดยการลัักลอบเข้้าออกผ่่านช่่องทางธรรมชาติิ จึึงไม่่ได้รั้ับ การกัักกัันและคััดกรองตามแนวทางปกติิ ซึ่่งเป็็นหนึ่่ง ในปััญหาสำคััญ ทำให้้ประสิิทธิิภาพการสกััดกั้้นการนำเชื้้อ เข้้าจากต่่างประเทศของจัังหวััดชายแดนภาคใต้้ตอนล่่าง ลดลง ผู้้ป่่วยรายแรกไปรัับการตรวจที่่สถานพยาบาล แห่่งที่่หนึ่่ง หลัังเริ่่มป่่วย 4 วััน ด้้วยอาการเริ่่มต้้นมีีไข้้ ปวดกล้้ามเนื้้อแต่่ไม่่ได้รั้ับการวินิิจฉััย จนกระทั่่งไปตรวจที่่ โรงพยาบาลแห่่งที่่สอง จึึงถููกวิินิิจฉััยยืืนยัันโรคโควิิด 19 จากรายงานสอบสวนโรคสมมติิฐานเกิิดจากการไป โรงพยาบาลครั้้งแรก ผู้้ป่่วยยัังไม่มี่ ีอาการระบบทางเดิินหายใจ ชััดเจนและไม่่ได้้ให้้ประวััติิความเสี่่ยงเรื่่องการเดิินทาง หรืือประวััติิการสััมผััสโรค ทำให้้แพทย์์ผู้้รัักษาไม่่ได้้ ส่่งตรวจยืืนยััน ดัังนั้้นประวััติิการเดิินทาง ประวััติิเสี่่ยง ต่่อการสััมผััสโรคมีีความสำคััญมาก ถ้้าผู้้ป่่วยและบุุคลากร การแพทย์์มีีความตระหนััก สื่่อสารกัันได้้ชััดเจนจะทำให้้ การวิินิิจฉััยเร็็วขึ้้นและลดการแพร่่เชื้้อในวงกว้้าง ปััจจััยสำคััญหนึ่่งในการการแพร่่ระบาดของสายพัันธุ์์ เบต้้าในวงกว้้างของภาคใต้้ตอนล่่าง คืือ การสััมผััสใกล้ชิ้ิด ผ่่านกิิจกรรมรวมกลุ่่มทางศาสนา ได้้แก่่ การรวมกลุ่่ม ในวัันอีีฎิ้้ลฟิิตริิ และการรวมกลุ่่มในโรงเรีียนสอนศาสนา เช่่นเดีียวกัับการระบาดระลอกแรกของภาคใต้้ตอนล่่าง ซึ่่งพบว่่าการรวมกลุ่่มทางศาสนาเป็็นปััจจััยเสี่่ยงสำคััญ(13) การสร้้างความเข้้าใจ ความตระหนัักให้้เกิิดการยอมรัับ มาตรการเว้้นระยะห่่าง สวมหน้้ากาก ล้้างมืือ หลีีกเลี่่ยง การรวมกลุ่่มในสถานการณ์์ระบาด รวมทั้้งมาตรการ คััดกรองตรวจหาเชื้้อในกลุ่่มเสี่่ยงจึึงมีีความสำคััญมาก ในการป้้องกัันการระบาดในภาคใต้้ตอนล่่างในอนาคต การศึึกษาครั้้งนี้้พบปััจจััยที่่สััมพัันธ์์กัับความเสี่่ยง ต่่อโรครุุนแรง ได้้แก่่ ผู้้ที่่มีีอายุุมากกว่่าหรืือเท่่ากัับ 60 ปีี ผู้้ที่่มีีประวััติิโรคปอดเรื้้อรัังและเพศชาย ซึ่่งสอดคล้้อง กัับการศึึกษาระบาดวิิทยาของผู้้เสีียชีีวิิตจากโรคติิดเชื้้อ ไวรััสโคโรนา 2019 จำนวน 58 รายแรกของประเทศไทย พบว่่าอััตราป่่วยตายเพิ่่มสููงขึ้้นในผู้้สููงอายุุและพบ อััตราป่่วยตายเพศชายสููงกว่่าเพศหญิิง(14) จากการ ศึึกษาในประเทศจีีนพบว่่าผู้้สููงอายุุมากกว่่า 60 ปีี อััตราป่่วยตายร้้อยละ 3.6-14.8 สููงกว่่ากลุ่่มอายุุต่่ำกว่่า ซึ่่งมีีอััตราป่่วยตายระหว่่างร้้อยละ 0.2-1.3(15) และ ผู้้ป่่วยที่่มีีประวััติิเป็็นโรคปอดเรื้้อรััง มีีอััตราป่่วยตาย เท่่ากัับร้้อยละ 6.3 สููงกว่่าผู้้ไม่่มีีโรคประจำตััวซึ่่งอััตรา ป่่วยตายเท่่ากัับ 0.9(15) จากข้้อมููลทางวิิชาการพบว่่า ผู้้มีีโรคเรื้้อรัังอื่่นๆ ได้้แก่่ โรคเบาหวาน โรคหััวใจ และ หลอดเลืือด โรคหลอดเลืือดสมอง รวมทั้้งภาวะอ้้วน เพิ่่มความเสี่่ยงต่่อการป่่วยด้้วยโรคติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 ที่่มีีอาการรุุนแรง(16) แต่่จากการศึึกษาครั้้งนี้้ ไม่่พบความสััมพัันธ์์ในการวิิเคราะห์์แบบ multivariate analysis เนื่่องจากขนาดกลุ่่มตััวอย่่างที่่มีีอาการรุุนแรง น้้อยไม่่เพีียงพอที่่จะทำให้้เห็็นความแตกต่่าง(17)

Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors for Severe Illness Sawanya Chantutanon and Choopong Sangsawang 90 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 สรุป ระหว่่างวัันที่่ 1 เมษายน–30 กัันยายน 2564 พบผู้้ติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้าในพื้้นที่่ ภาคใต้้ตอนล่่าง จำนวน 551 ราย จากผู้้ป่่วยยืืนยััน ทุุกสายพัันธุ์์ 2,911 ราย คิิดเป็็นร้้อยละ 18.93 อายุุ มััธยฐาน 34 ปีี นัับถืือศาสนาอิิสลามร้้อยละ 96 พบสููงสุุด ใน 3 จัังหวััด ได้้แก่่ นราธิิวาส สตููล และปััตตานีี ในกลุ่่ม ผู้้ติิดเชื้้อไวรััสโคโรนา 2019 สายพัันธุ์์เบต้้าจำนวน 286 ราย มีีอาการรุุนแรงหรืือเสีียชีีวิิต 14 ราย ปััจจััย ที่่สััมพัันธ์์กัับการเกิิดโรครุุนแรงหรืือเสีียชีีวิิต ได้้แก่่ ผู้้ที่่มีีอายุุตั้้งแต่่ 60 ปีี และผู้้ที่่มีีโรคประจำตััวเรื้้อรััง การระบาดของเชื้้อ SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์เบต้้า ในภาคใต้้ตอนล่่างเกี่่ยวข้้องกัับการลัักลอบเข้้าประเทศ และกิิจกรรมรวมกลุ่่มทางศาสนา ควรเพิ่่มมาตรการ เฝ้้าระวัังพื้้นที่่ชายแดน การป้้องกัันการป่่วยรุุนแรง และเสีียชีีวิิตเน้้นมาตรการป้้องกัันควบคุุมโรคและ ความครอบคลุุมวััคซีีนในผู้้สููงอายุุและผู้้มีีโรคเรื้้อรััง กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุุณ สำนัักงานสาธารณสุุขจัังหวััดนราธิิวาส สำนัักงานสาธารณสุุขจัังหวััดปััตตานีี สำนัักงานสาธารณสุุข จัังหวััดสตููล สำนัักงานสาธารณสุุขจัังหวััดยะลา สำนัักงาน สาธารณสุุขจัังหวััดสงขลา สำนัักงานสาธารณสุุข จัังหวััดตรััง และสำนัักงานสาธารณสุุขจัังหวััดพััทลุุง ที่่ให้้ความอนุุเคราะห์์ อำนวยความสะดวกแก่่ผู้้ศึึกษา ในการรวบรวมข้้อมููลในครั้้งนี้้เป็็นอย่่างดีี เอกสารอ้างอิง 1. World Health Organization. Coronavirus disease (COVID-19). [online]. 2021; [cited 2021 Dec 24]. Available from: URL: https:// www.who.int/emergencies/diseases/ novel-coronavirus-2019/question-andanswers-hub/q-a-detail/coronavirusdisease-covid-19. 2. Tang YW, Schmitz JE, Persing DH, Stratton CW. Laboratory diagnosis of COVID-19: current issues and challenges. J Clin Microbiol 2020; 58(6): e00512-20. 3. World Health Organization. Origin of SARS-CoV-2. [online]. 2020; [cited 2021 Aug 14]; [2 screens]. Available from: URL: https:// apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/ 332197/WHO-2019-nCoV-FAQ-Virus_ origin-2020.1-eng.pdf. 4. World Health Organization. WHO-convened global study of origins of SARS-CoV-2: China part. [online]. 2021; [cited 2021 Aug 14]; [120 screens]. Available from: URL: https:// www.who.int/publications/i/item/whoconvened-global-study-of-origins-of-sarscov-2-china-part. 5. ProMED-mail. Novel coronavirus (02): Thailand ex China (HU) WHO. Archive Number: 20200113.6886644. [online]. 2020; [cited 2022 Jan 19]. Available from: URL: https://promedmail.org/promedpost/?id=20200113.6886644. 6. Cov-lineages.org. Lineage list. [online]. 2019; [cited 2022 Jan 19]. Available from: URL: https://cov-lineages.org/lineage_list.html. 7. World Health Organization. Episode

39- update on virus variants. [online]. 2021; [cited 2022 Jan 14]. Available from: URL: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/mediaresources/science-in-5/episode-39---update-on-virus-variants. 8. World Health Organization. Tracking SARS-CoV-2 variants. [online]. 2021; [cited 2022 Jan 19]. Available from: URL: https://www.who.int/activities/trackingSARS-CoV-2-variants. 9. World Health Organization. Naming the coronavirus disease (COVID-19) and the virus that causes it. [online]. 2020; [cited 2022 Jan 14]; [2 screens]. Available from: URL: https://www.who.int/emergencies/

ระบาดวิิทยาของเชื้้�อไวรััส SARS-CoV-2 สายพัันธุ์์�เบต้้า (B.1.351) และปััจจััยเสี่่�ยงต่่อการเกิิดอาการรุุนแรง สวรรยา จัันทููตานนท์์ และ ชููพงศ์์ แสงสว่่าง 91 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirusdisease-(covid-2019)-and-the-virusthat-causes-it. 10. Liu Y, Rocklöv J. The reproductive number of the Delta variant of SARS-CoV-2 is far higher compared to the ancestral SARS-CoV-2 virus. J Travel Med 2021; 28(7): taab124. (3 pages). 11. Manatu H. Covid-19 variants update. [online]. 2021; [cited 2021 Nov 28]; [67 screens]. Available from: URL: https://www.health. govt.nz/system/files/documents/pages/ variants-update-27-april-2022_0.pdf. 12. Paredes MI, Lunn SM, Famulare M, Frisbie LA, Painter I, Burstein R, et al. Associations between SARS-CoV-2 variants and risk of COVID-19 hospitalization among confirmed cases in Washington State: a retrospective cohort study. Clin Infect Dis 2022; ciac279. (19 pages). 13. Phiriyasart F, Chantutanon S, Salaeh F, Roka A, Thepparat T, Kaesaman S, et al. Outbreak investigation of coronavirus disease (COVID-19) among Islamic missionaries in southern Thailand, April 2020. OSIR Journal 2020; 13(2): 48-54. 14. Chailek C, Taweewigyakarn P, Yimchoho N, Saritapirak N, Namwat C, Sawanpanyalert N. Epidemiological characteristics and medical visits of the first 58 COVID-19 deaths, January–June 2020, Thailand. OSIR Journal 2021; 14(1): 1-11. 15. Team E. The epidemiological characteristics of an outbreak of 2019 novel coronavirus diseases (COVID-19)-China, 2020. China CDC Wkly 2020; 2(8): 113-22. 16. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19. [online]. 2022; [cited 2022 May 08]. Available from: URL: https://www.cdc. gov/coronavirus/2019-ncov. 17. Mysiak K. The relationship between significant, power, sample size & effect size. [online]. 2020; [cited 2022 May 08]; [9 screens]. Available from: URL: https:// towardsdatascience.com/the-relationshipbetween-significant-power-sample-sizeeffect-size-899fcf95a76d.

Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors for Severe Illness Sawanya Chantutanon and Choopong Sangsawang 92 วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ปีที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Sawanya Chantutanon1 and Choopong Sangsawang2 1 Office of Disease Prevention and Control 12 Songkhla, Songkhla 90000, Thailand 2 Field Epidemiology Training Center (FETC), Office of Disease Prevention and Control 12 Songkhla, Songkhla 90000, Thailand. Epidemiology of SARS-CoV-2 Beta Variant (B.1.351) and Risk Factors for Severe Illness in the Southernmost Provinces of Thailand, April-September 2021 ABSTRACT This study aimed to explore the epidemiology of the SARS-CoV-2 Beta variant (B.1.351) outbreak in the seven southernmost provinces of Thailand. A cross-sectional study was conducted on confirmed Beta variant cases. The surveillance and case investigation data of the Office of Disease Prevention and Control 12 Songkhla were reviewed from 1 April to 30 September 2021. The Beta variant was confirmed in 551 cases (18.93%) out of 2,911 lineage-known SARS-CoV-2 cases. The top three highest proportions of Beta-variant cases were found in Narathiwat, Satun and Pattani provinces at 50.78%, 34.13% and 13.66%, respectively. Of all cases, 294 were male and 217 were female. The age range was 1–100 years (median 34 years). Most of cases were Thai (99.27%), most of whom were Muslim (96%). The first cluster of Beta variant was found in May 2021, while the peak of cases occurred in July 2021. Risk factors of the outbreak were gatherings in Islamic activities. The retrospective cohort study was conducted by reviewing outpatient cards and investigation documents of 286 patients (including 14 severely ill cases or deaths) who were diagnosed with Beta variant in Narathiwat and Satun from 1 April to 30 September 2021. The risk factors of severe or dead cases were age over 60 years (adjusted OR = 11.26, 95%CI: 2.42–52.59), chronic lung diseases (adjusted OR = 23.80, 95%CI: 1.23–458.61) and male gender (adjusted OR = 7.36, 95%CI: 1.02–52.76). Risk factors of the Beta variant outbreak were illegal influx across the Thai-Malaysian border and Islamic gatherings. Thus, the following should be undertaken: strengthening border surveillance to prevent illegal influx; banning religious gatherings, and improving vaccination coverage in elderly and chronically ill persons. Keywords: COVID-19, Beta variant, Risk factors for severe illness, Southernmost provinces of Thailand

นิพนธตนฉบับ ว กรมวิทย พ 2565; 64 (2): 93-105 93 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Sarayut Radapong,1 Tiyanee Sahad,1 Nathaphat Harnkit,1 Praw Suppajariyawat,1 Pilailuk Akkpaiboon Okada,2 Wandee Meechalad,2 Pornchai Sincharoenpokai,1 Somchit Niumsakul,1 Sekrachatakorn Buaboa,1 Sakwichai Ontong,1 Kenneth J. Ritchie3 and Siriwan Chaisomboonpan1 1 Medicinal Plant Research Institute, 2 National Institute of Health, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand 3 Center for Natural Products Discovery (CNPD), Liverpool John Moores University, Byrom Street, Liverpool L3 3AF, United Kingdom Anti-SARS-CoV-2 Activity Screening of the Selected Thai Medicinal Plants and Potential Host-target Molecules ABSTRACT Coronavirus disease 2019 (COVID-19), the pandemic, is caused by a virus called SARSCoV-2. The objective of this study was to investigate the anti-SARS-CoV-2 properties of some selected medicinal plants used as antipyretic in Thai traditional medicines. They were screened for anti-SARSCoV-2 activity using plaque reduction assay. The extracts were further investigated for activity in enzymatic inhibition and gene expression assays of several host-target molecules. The results revealed that the aqueous extracts of Mesosphaerum suaveolens (L.) Kuntze (HSF, HSD) and Helicteres isora L. (HID) at the highest concentrations of 5, 5 and 10 mg/mL showed the highest anti-SARS-CoV-2 activities of 100%, 100% and 99.49%, respectively. Rosmarinic acid (RA), one of the phytochemicals found in M. suaveolens (L.) Kuntze and H. isora L., at 0.625 mg/mL, gave an antiviral activity of 94.49%. RA also showed the highest relative ACE2 inhibition of 70.25% at 100 µg/mL with no toxicity to the cells, whereas the other extracts showed a lower level of relative ACE2 inhibition. RA also reduced the expression of ACE2 and TMPRSS2 but not PIKfyve or cathepsin L in Calu-3, lung epithelial cell lines. In conclusion, HSF, HSD, HID and RA provided anti-SARS-CoV-2 activity, which could limit the viral infection in the early phase. The extracts should be further investigated for anti-SARS-CoV-2 activity in animals and clinical trials for development as herbal drugs. Keywords: Anti-SARS-CoV-2 activity, ACE2 inhibition, Target molecules, COVID-19 Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 31 January 2022 Revised: 9 March 2022 Accepted: 2 June 2022

94 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Anti-COVID19 Activity of the Selected Medicinal Plants and Potential Host-target Molecules Sarayut Radapong et al. Introduction Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by a virus called SARS-CoV-2. Patients will develop respiratory symptoms, including fever, cough, and shortness of breath or difficulty breathing.(1) It can cause complications such as pneumonia, kidney failure or even death. It was first detected in December 2019 in Wuhan, China. The World Health Organization then declared an international public health emergency and a global pandemic in March 2020. Currently, Thailand has cumulatively 2.8 million infected cases and 22,849 deaths, whereas globally there have been 285 million cases and 5.4 million deaths (February 2022).(1) The Economist magazine reported the value of global economic losses in 2020–2021 due to the coronavirus pandemic at $10.3 trillion based on a 6.6% drop in global GDP compared to forecasts in the absence of COVID-19. The total economic damage to Thailand is estimated at 18.4 trillion baht.(2) The COVID-19 outbreak now has a huge impact on the people and economies around the world. The Thai government has issued various policies and measures to help alleviate the suffering of the affected people by developing or adopting vaccines, medicines and related medical products. It is very important for the treatment and prevention of this virus. However, vaccine and drug development takes a long time and costs a lot of money. The use of herbal medicines or traditional medicines that could prevent, cure or reduce illnesses from COVID-19 is another alternative measure. Thus, such health products or modern drugs have to be developed. From such events, some people have turned to use medicinal plants or alternative medicines, which are recorded in the Thai Herbal Pharmacopoeia or other traditional pharmacopoeia. Most of them showed antipyretic property and alleviating viral diseases including Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees (Family Acanthaceae), Cinnamomum verum J.Presl. (Family Lauraceae), Cinnamomum bejolghota (Buch.-Ham.) Sweet (Family Lauraceae), Houttuynia cordata Thunb. (Family Saururaceae), Tiliacora triandra (Colebr.) Diels (Family Menispermaceae), Mesosphaerum suaveolens (L.) Kuntze (Family Lamiaceae), Cinchona calisaya Wedd. (Family Rubiaceae), Helicteres isora L. (Family Malvaceae) or even Kaempferia parviflora Wall. ex Baker (Family Zingiberaceae). Some of them were reported to alleviate symptoms or inhibit the coronavirus. A. paniculata (Burm.f.) Nees extract capsules containing 60 mg andrographolide were reported to reduce fever, cough, sore throat, sputum volume and headache in COVID-19 clinical trials.(3) Boesenbergia rotunda (L.) Mansf. (Family Zingiberaceae) and Zingiber officinale Roscoe (Family Zingiberaceae) extracts showed potent activity against COVID-19 in vitro in the pre-entry and post-infection stages.(4) Procyanidin A2, procyanidin B1 and cinnamtannin B1 in C. verum J.Presl. posed activity against SARS-CoV by inhibiting clathrin-mediated endocytosis.(5) Moreover, quercetin, the active compound in H. cordata Thunb., was found to inhibit chymotrypsin-like cysteine protease (3CLpro) of SARS-CoV-2.(6) The infection process of the virus begins with the virus entering the cell by attaching a spike (S) glycoprotein to human receptor cells. The main receptor is the host angiotensinconverting enzyme 2 (ACE2) receptor, which is

95 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุลเปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย ศรายุธ ระดาพงษ และคณะ cleavaged together with transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2) before endocytosis. Once it enters the cell, the virus also needs the PIKfyve enzyme to form an endosome and transport virus particles in the cytoplasm. This process also needs cathepsin L protease, which is responsible for endosome maturity. The inhibition of PIKfyve and cathepsin L protease has been shown to be effective against SARS-CoV-2, Ebola virus (EBOV) and African swine fever in the early and middle stages of the infection. The virus then gets disassembled to release the nucleocapsid and the viral genome. The transcription process utilizes RNA-dependent RNA synthesis to generate mRNAs to translate into structural and non-structural proteins. Finally, the virion progeny is generated via rough ER, Golgi apparatus and exocytosis.(7) This research, therefore, aimed to investigate the anti-viral property of the medicinal plant extracts to the main host receptors and proteases focusing on ACE2 and others such as TMPRSS2, PIKfyve and cathepsin L, which were involved in the pre-entry and early phases of infection. Materials and Methods Cell culture Vero E6 cells, African green monkey kidney epithelial cells (ATCC, NY, USA), were used in antiviral property investigation. Calu-3, lung epithelial cell line (ATCC, NY, USA), was used in the gene expression assay. The cells were grown in Eagle's minimum essential medium (EMEM) (Gibco, NY, USA) containing 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acid, 1 mM sodium pyruvate and 10% fetal bovine serum at 37º C in a 5% CO2 incubator. Virus SARS-CoV-2 (Delta variant/EPI_ISL_ 3797061) was obtained from a human nasopharyngeal swab. The virus was propagated in Vero E6 cells by three passages to establish a high-titer stock and stored at –80° C for use in all experiments. Virus titration as TCID50 titer/mL was performed. All the experiments with live SARS-CoV-2 were performed at a certified biosafety level 3 facility of the National Institute of Health, Department of Medical Sciences, Thailand. Standards Rosmarinic acid (RA) (> 98% HPLC grade) and quinine sulfate (QS) (> 98% HPLC grade) from Merck KGaA (Darmstadt, Germany) were used. Plant Materials Fresh aerial parts of M. suaveolens (L.) Kuntze and green-brown fruits of H. isora L. were collected from Kanchanaburi province, Thailand, in February 2019 and September 2020, respectively, while fresh leaves of T. triandra (Colebr.) Diels, fresh bark of C. calisaya Wedd. and fresh rhizomes of K. parviflora Wall. ex Baker were from Phetchaburi, Chiang Mai and Tak provinces, Thailand, in October 2020, December 2020 and January 2021, respectively. The plants were identified by Mr. Sakwichai Ontong, a botanist, based on the plant identification handbook of Royal Botanic Gardens, Kew, London, United Kingdom. Voucher specimens were collected as DMSC5291, DMSC5270, DMSC5240, DMSC5295 and DMSC5285 for M. suaveolens (L.) Kuntze, H. isora L., T. triandra (Colebr.) Diels, C. calisaya Wedd. and K. parviflora

96 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Anti-COVID19 Activity of the Selected Medicinal Plants and Potential Host-target Molecules Sarayut Radapong et al. Wall. ex Baker, respectively. All of them were deposited at the DMSc International Herbarium, Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health. Plant Extraction The plant parts were cleaned up with tap water, cut into small pieces about 1 cm in length. For the dried plant extraction of M. suaveolens (L.) Kuntze, H. isora L., and K. parviflora Wall. ex Baker, the materials were dried in a hot air oven at 45–50 º C for 24–48 hours and then ground into powder. The dried powder then was refluxed with distilled water (360 g of the powder in 3 L of water), the plant part was filtered and passed through the extraction process with distilled water two times consecutively. The aqueous extract of each plant, M.suaveolens (L.) Kuntze, H. isora L., and K. parviflora Wall. ex Baker, was then pooled, concentrated and dried by rotary evaporation yielding HSD, HID and KPD extracts, respectively. The dried extracts were collected and kept in a light protective bottle at –20º C until use. For the fresh parts extraction of M. suaveolens (L.) Kuntze, T. triandra (Colebr.) Diels and C. calisaya Wedd., fresh small pieces were ground and then the extractions were conducted using the same procedure, but with lyophilization instead of rotary evaporation to dry the powder, and yielding HSF, TTF and CCF extracts, respectively. The extracts were also analyzed for its phytochemical compounds with quality control using high performance liquid chromatography (HPLC) with diode array detector. Rosmarinic acid was used as a standard for HSF, HSD and HID, whereas quercetin, quinine sulfate and 5-hydroxy-7-methoxy flavanone were used for TTF, CCF and KPD, respectively. The plant extractions with the quality control were conducted at the Herbal Quality Assurance Center, Medicinal Plant Research Institute, Department of Medical Sciences. The data will be further published elsewhere. MTT assay The cells were seeded at 5 ×103 cells in 100 µL medium per well of 96-well plates and left in the incubator for 24 hours. The medium was removed and the cells were treated with eight different concentrations of each compound in triplicate and then incubated for 48 hours. The medium was replaced with 200 µL MTT reagent and then continued to incubate for 4 hours. The MTT solution was discarded and 200 µL DMSO was added to each well to dissolve the purple formazan product. The absorbance of the formazan product of viable cells was read using the microplate reader at 570 nm. The background absorbance was reduced by the blank and %viability was calculated compared to the control. Anti-SARS-CoV-2 activity screening using plaque reduction assay This assay was designed to investigate the anti-viral property at the pre-entry phase modified from Kanjanasirirat, P. et al., (2020).(4) The extracts were pre-incubated with SARSCoV-2 at 37° C for 1 hour before transferring 200 µL of the solution with virus particles onto the monolayer of vero E6 cells. Viral adsorption was allowed for 1 hour in the CO2 incubator. The cells were washed with a fresh medium to remove both the unbound viral particles and the extract/compound. Then 3 mL overlaid medium was added into the wells. The semi-solid medium was allowed to set and all plates were placed in the incubator for 7 days. The overlaid

97 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุลเปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย ศรายุธ ระดาพงษ และคณะ medium was discarded and cells were fixed with 5% formaldehyde and then stained with 0.5% (w/v) crystal violet. The excess colour was washed with tap water. The plaques were counted and % inhibition was calculated compared to the controls (without the compound). All extracts were used at previously determined non-toxic concentrations. ACE2 inhibition assay The enzymatic inhibition assay was conducted using angiotensin II converting enzyme (ACE2) activity assay kit (Abcam, MA, USA) at the Toxicology Laboratory, Department of Medical Sciences. The enzyme solution and reagents were prepared following the procedure described in the manufacturer’s protocol. The plant extracts were diluted with water at the highest concentration, which was not toxic to Calu-3 cells. Totally, 48 µL of ACE2 assay buffer was mixed with 2 µL diluted ACE2 enzyme solution and then the solution was added to the diluted extracts or the standard inhibitor (the background and enzyme controls were also tested). The mixed solutions were placed at room temperature for 15 min. Totally, 40 µL ACE2 substrate mix was then added to the wells and immediately placed in spectrofluorometer and the fluorescence signal (Ex/Em = 320/420 nm) was measured after being in kinetic mode for 1 hour. The relative inhibition activity (%) of the sample was calculated using a relative fluorescence unit (RFU) compared to enzyme control. Gene expression using real-time reversetranscription polymerase chain reaction (RT-PCR) Calu-3 cells were seeded at 5 × 105 cells/ well in 6-well plates for 24 hours and then treated with the compounds or extracts at concentrations that were not toxic to the cells for 24 hours. Total RNA of each sample was extracted using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). According to the manufacturer’s protocol, RNA was re-suspended in 30 µL of nuclease-free water and then the products were run on agarose gels to check the quality of the RNA. cDNA was synthesized using QuantiTect Rev. Transcription Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) following the manufacturer’s protocol. Briefly, 2 µg template RNA was added to the reversetranscription master mix and then the samples tubes were incubated at 42 ºC for 15 min. The cDNA samples were tested in triplicate with quantitative PCR using a QuantiTect SYBR Green PCR Reagents kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Totally, 2 µL of each sample was mixed with SYBR Green PCR Master Mix and 10x QuantiTect Primers (Qiagen, Valencia, CA, USA), and then the real-time PCR (RT-qPCR) was performed using the manufacturer’s protocol in Thermal cycler (PCR) (Analytik Jena GmbH, Valencia, Jena, Germany). mRNA ratios relative to the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) housekeeping gene were calculated for the standardization of gene expression levels. A melting curve analysis was also performed to verify the specificity and identity of PCR products. For selected genes, the data were analyzed using the equation described by Livak and Schmittgen(8) as follows: the amount of target = 2−∆∆Ct. The average ∆Ct from the untreated cells is a calibrator for each gene tested. This assay was conducted at the Toxicology Laboratory, Medicinal Plant Research Institute, Department of Medical Sciences. Statistical analysis The total percentage of plaque reduction assay was expressed in the mean of duplicated

98 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Anti-COVID19 Activity of the Selected Medicinal Plants and Potential Host-target Molecules Sarayut Radapong et al. Table 1 Percentage yields of the herbal extracts Extracts Plant Parts used Weight Plant Yield (%) materials (g) Extracts (g) HSF M. suaveolens (L.) Kuntze Fresh aerial parts 1,200 26.20 2.18 HSD M. suaveolens (L.) Kuntze Air-dried aerial parts 360 72.42 20.11 HID H. isora L. Air-dried fruits 800 114.56 14.32 TTF T. triandra (Colebr.) Diels Fresh leaves 160 33.19 20.74 CCF C. calisaya Wedd. Fresh barks 500 55.60 10.12 KPD K. parviflora Wall. ex Baker Air-dried rhizomes 600 70.33 11.72 experiments. The percentage of relative ACE2 inhibition and relative quantity of mRNA expression was expressed as mean±SD (n = 3). Statistical analysis of ACE2 enzymatic inhibition and gene expression of mRNA was carried out using the one-way analysis of variance followed by Dunnett's test. Results The six aqueous extract - HSF, HSD, HID, TTF, CCF and KPD - were obtained using reflux method and dried with rotary evaporation or using lyophilization technique. The highest percentage yield was for TTF at 20.74%, while those for HSD, HID, KPD, CCF, and HSF were 20.11%, 14.32%, 11.72%, 10.12% and 2.18%, respectively. RA quantities determined by using HPLC analysis in HSF, HSD and HID extracts were 0.35±0.02%, 0.18±0.01% and 0.29±0.01% (w/w), respectively. The weight of the plant materials and the percentage yields for the six extracts were shown in Table 1 and the chemical profiles of RA in HSF, HSD and HID were provided in Figure 1. The activities of the plant extracts to reduce the pre-entry phase of SARS-CoV-2 were evaluated. Vero E6 cells were used as host cells for the virus. The percentage of the plaque reduction was calculated compared with the virus controls. HSD and HSF showed the highest plaque reduction of 100% at 5 mg/mL while HID, TTF, CCF, KPD and RA gave lower plaque reduction of 99.49%, 95.95%, 88.95%%, 85.24% and 94.49% at 10, 10, 0.625, 2.5 and 0.625 mg/mL, respectively. The anti-viral activities at different concentrations of the six extracts were shown in Table 2.

99 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุลเปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย ศรายุธ ระดาพงษ และคณะ Figure 1 Chromatograms of rosmarinic acid in the three extracts, inj. vol. 10 µL, monitored at 330 nm A) HSF at 0.836 mg/mL; B) HSD at 0.479 mg/mL; C) HID at 0.747 mg/mL. Table 2 Anti-viral activities at the highest concentrations of the herbal aqueous extracts which were not toxic to the cells. The data was expressed as the mean, n = 2. Herbal extracts/ compounds The highest concentration tested (mg/mL) Plaque reduction (%) HSD 5.000 100.00 HSF 5.000 100.00 HID 10.000 99.49 TTF 10.000 95.95 CCF 0.625 88.95 KPD 2.500 85.24 RA 0.625 94.49 QS 0.250 81.65

100 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Anti-COVID19 Activity of the Selected Medicinal Plants and Potential Host-target Molecules Sarayut Radapong et al. Figure 2 ACE2 enzymatic inhibitory activity at the concentrations which were not toxic to calu-3 cells of the standard inhibitor (STD), (A) HSD, (B) HID and (C) RA. The data was expressed as mean ± SD, n = 3. Statistical analysis was carried out using One-Way analysis of variance followed by Dunnett's test (*p < 0.5). ACE2 enzymatic inhibition of the extracts was evaluated at the highest concentration, which was not toxic to Calu-3 cells. HSD, HID and RA showed the inhibition activities in the dose-response relationship. RA showed the highest activity compared to others giving the relative inhibition values of 70.25%, 55.03% and 40.00% at the doses of 100, 50 and 25 µg/mL, respectively. HSD showed the inhibition values of 40.37%, 25.83% and 11.20% at the doses of 200, 100 and 50 µg/mL, respectively, while HID’s inhibition values were 20.88%, 18.53% and 12.79% at the doses of 50, 25 and 12.5 µg/ mL, respectively. ACE2 enzymatic inhibition values at different concentrations of HSD, HID and RA were shown in Figure 2. Gene expression assay of four main genes for viral entry and progression processes was conducted. The lung cells were treated with RA at the concentrations of 25, 50 and 100 µg/mL. ACE2 and TMPRSS2 genes were down-regulated compared to the untreated control and demonstrated a dose-response relationship, whereas the expression of PIKfyve and cathepsin L remained the same at the doses of 25 and 50 µg/mL. At the highest concentration of 100 µg/mL, RA up-regulated PIKfyve and cathepsin L (around 1.4- to 2-fold increase at 100 µg/mL). The mRNA expression data of ACE2, TMPRSS2, PIKfyve and cathepsin L in Calu-3 cells treated with different RA concentrations were shown in Figure 3.

101 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุลเปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย ศรายุธ ระดาพงษ และคณะ Figure 3 Relative quantity of mRNA expression of ACE2, TMPRSS2, PIKfyve and cathepsin L in calu-3 cells treated with RA at 25, 50 and 100 µg/mL versus control data set for 24 h. The data was expressed as mean±SD, n = 3. Statistical analysis was carried out using One-Way analysis of variance followed by Dunnett's test (*p < 0.5, **p < 0.005, ***p < 0.0005 and ****p < 0.0001). Discussion Various Thai medicinal plants with traditional uses against viral diseases and antipyretic properties were screened for anti-SARS-CoV-2 activity. The aqueous extracts of M. suaveolens (L.) Kuntze and H. isora L. were reported here to pose anti-SARS-CoV-2 activity for the first time. The aqueous crude extracts were derived from fresh and air-dried plant parts. The fresh one has imitated the traditional extraction method(9) using fresh plants and then the filtrate was dried using lyophilization to reduce the effect of heat. On the other hand, the air-dried plant extraction was undertaken and then the filtrate was concentrated and dried using rotary evaporation. RA is one of the constituents quantified in HSF and HSD. RA content determined in HSF was about twice that in HSD. RA in HSD might be degraded during the drying process. The extracts were screened for anti-virus properties at high concentrations, which were not toxic to vero cells. HSF and HSD posed high anti-SARSCoV-2 activity of 100% plaque reduction at 5 mg/mL. RA also showed anti-SARS-CoV-2 activity of 94.49% at 0.625 mg/mL. RA, therefore, may contribute to the anti-viral property of the extracts. RA and its derivatives were reported to be the constituents of M. suaveolens (L.) Kuntze and H. isora L.,(10,11) which could cause the aqueous extract of H. isora L. exhibit the

102 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Anti-COVID19 Activity of the Selected Medicinal Plants and Potential Host-target Molecules Sarayut Radapong et al. activity. Besides, M. suaveolens (L.) Kuntze is an aromatic herb containing various compounds such as essential oils, phenolics, diterpenoids, triterpenoids, steroids, alkaloids and flavonoids.(10) Ursolic acid is one of the phytochemicals in the plants reported to show antispasmodic(11) and antiviral activity against rotaviruses, HIV, influenza and hepatitis B and C viruses.(12-15) Moreover, ursolic acid was identified as a strong protease inhibitor to the main protease (Mpro) of SARS-CoV-2 based on the molecular docking approach.(16) RA inhibited ACE2 enzymatic reaction. However, the concentrations of HSD and HID depended on cytotoxic level of the extracts. ACE2 inhibition property of RA might be one of the important mechanisms contributing to the antiviral activity. Gene expression was investigated in Calu-3, lung epithelial cells, which expressed ACE2, TMPRSS2, PIKfyve and cathepsin L. The expression showed that RA down-regulated ACE2 and TMPRSS2 in the dose-response relationship but not PIKfyve and cathepsin L. The highest dose of RA was likely to up-regulate PIKfyve and cathepsin L expression but not higher than twofold. RA was also reported to show high efficacy in terms of molecular interaction and drug-likeness properties against ACE2 and TMPRSS2(17) or SARS-CoV 3CLpro(18) by molecular docking analysis. The mRNA expression analysis showed that the compound inhibited ACE2 along with TMPRSS2 which had been highlighted in recent studies to be one of the main targets of SARSCoV-2 infection.(19,20) We also reported here for the first time that the aqueous extracts of fresh leaves of T. triandra (Colebr.) Diels (TTF), C. calisaya Wedd. (CCF) and K. parviflora Wall. ex Baker (KPD) were also found to possess in vitro anti-SARS-CoV-2 activity. T. triandra (Colebr.) Diels has been generally used in cuisine and traditional medicine in Southeast Asia. The main compounds of the aqueous extracts were analyzed as quercetin, cyanidin, gallic acid, chlorophyll, rutin, tannic acid and catechin.(21) Some sources reported that chlorophyll derivatives and quercetin could be potential therapeutic agents for treating COVID-19.(6,22) C. calisaya Wedd. has been identified to be the primary source of quinine, used as antimalarial. Quinine was reported that it targeted 6LU7 COVID-19 protease resulting in inhibition of the viral infection by in silico analysis.(23) K. parviflora Wallich. ex Baker belongs to the family Zingiberaceae, the same as B. rotunda (L.) Mansf. and Z. officinale Roscoe. This plant family has been reported to be the source of phytochemicals which were active against SARS-CoV-2 such as 6-gingerol from Z. officinale Roscoe and panduratin A from B. rotunda (L.) Mansf.(4) Currently, the SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) is being targeted by several inhibitors such as favipiravir, remdesivir and molnupiravir; and there are some pieces of evidence of drug resistance.(24) HSF, HSD, HID and RA provided anti-SARS-CoV-2 activity targeting the host molecules, which could limit the viral infection in the early phase and drug resistance. These extracts might be developed as anti-SARS-CoV-2 candidates in pre-clinical and clinical trials. Moreover, these phytochemical compounds should also be further isolated from the six extracts which were investigated for anti-SARS-CoV2 activity.

103 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุลเปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย ศรายุธ ระดาพงษ และคณะ Conclusion Based on the results, the two extracts of M. suaveolens (L.) Kuntze (HSF, HSD) showed the highest inhibitory activity (with no toxicity to the cells) against SARS-CoV-2 at 100% with the concentration of 5 mg/mL, while HID, TTF, CCF and KPD gave lower levels of plaque reduction of 99.49%, 95.95%, 88.95% and 85.24% at the doses of 10, 10, 0.625 and 2.5 mg/mL, respectively. HSD and HID showed ACE2 enzymatic inhibition. RA, one constituent of M. suaveolens (L.) Kuntze and H. isora L., also showed potent inhibition. RA down-regulated the expression of ACE2 and TMPRSS2 but not PIKfyve or cathepsin L in Calu-3 which were involved in the pre-entry and early phases of infection. The phytochemicals reported here in these selected medicinal plants should be developed as anti-SARS-CoV-2 candidates in animals and clinical trials or further isolated for other potential compounds against SAR-CoV-2. This is the first report on the in vitro anti-SARS-CoV-2 properties with detailed mechanisms of action of the selected Thai medicinal plant extracts. Acknowledgements This research was supported by the Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health. References 1. Department of disease control. Corona virus 2019 (COVID-19). [online]. 2022; [cited 2022 Jan 17]. Available from: URL: https://ddc. moph.go.th/viralpneumonia. 2. พรายพล คุมทรัพย. ความสูญเสียทางเศรษฐกิจจาก โควิด-19. [online]. 2022; [cited 2022 Jan 17]; [4 screens]. Available from: URL: https://www. bangkokbiznews.com/news/detail/938335. 3. Benjaponpithak A, Visithanon K, Sawaengtham T, Thaneerat T, Wanaratna K. Short communication on use of andrographis herb (Fa Thalai Chon) for the treatment of COVID-19 patients. J Thai Trad Alt Med 2021; 19(1): 229-33. 4. Kanjanasirirat P, Suksatu A, Manopwisedjaroen S, Munyoo B, Tuchinda P, Jearawuttanakul K, et al. High-content screening of Thai medicinal plants reveals Boesenbergia rotunda extract and its component Panduratin A as anti-SARS-CoV-2 agents. Sci Rep 2020; 10: 19963. (12 pages). 5. Remali J, Aizat WM. A review on plant bioactive compounds and their modes of action against coronavirus infection. Front Pharmacol 2021; 11: 589044. (13 pages). 6. Chiow KH, Phoon MC, Putti T, Tan BK, Chow VT. Evaluation of antiviral activities of Houttuynia cordata Thunb. extract, quercetin, quercetrin and cinanserin on murine coronavirus and dengue virus infection. Asian Pac J Trop Med 2016; 9(1): 1-7. 7. Gil C, Ginex T, Maestro I, Nozal V, Barrado-Gil L, Cuesta-Geijo MÁ, et al. COVID-19: drug targets and potential treatments. J Med Chem 2020; 63(21): 12359-86. 8. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆CT method. Methods 2001; 25(4): 402-8. 9. Faculty of Pharmacy, Ubonratchathani university. H. suaveolens. [online]. 2022; [cited 2022 Jan 17]; [5 screens]. Available from: URL: http://www.phargarden.com/main. php?action=viewpage&pid=268.

ions to inhibit SARS-CoV-2 RNA synthesis? Front Plant Sci 2020; 11: 1270. (4 pages). 23. Srivastava A, Kumar A, Tiwari G, Kumar R, Misra N. In Silico investigations on the potential inhibitors for COVID-19 protease. arXiv preprint 2020: 2003.10642. (12 pages). 24. Vitiello A. Sars-Cov-2 and risk of antiviral drug resistance. Irish J Med Sci. [online]. 2021; [cited 2022 Jan 17]; [2 screens]. Available from: URL: https://link.springer.com/ content/pdf/10.1007/s11845-021-02820-y.pdf.

105 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุลเปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย ศรายุธ ระดาพงษ และคณะ ศรายุธ ระดาพงษ1 ตีญานี สาหัด1 ณฐภัทร หาญกิจ1 พราว ศุภจริยาวัตร1 พิไลลักษณ อัคคไพบูลย โอกาดะ2 วันดี มีฉลาด2 พรชัย สินเจริญโภไคย1 สมจิตร เนียมสกุล1 เสกรชตกร บัวเบา1 ศักดิ์วิชัย ออนทอง1 Kenneth J Ritchie3 และ ศิริวรรณ ชัยสมบูรณพันธ1 1 สถาบันวิจัยสมุนไพร 2 สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000 3 Centre for Natural Products Discovery, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, มหาวิทยาลัย Liverpool John Moores, Byrom Street, ลิเวอรพูล L3 3AF สหราชอาณาจักร การคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 และโมเลกุล เปาหมายการออกฤทธิ์ของพืชสมุนไพรไทย บทคัดยอ โรคโคโรนาไวรัส 2019 หรือโควิด 19 เปนโรคระบาดที่เกิดขึ้นทั่วโลกมีสาเหตุจากการติดเชื้อไวรัส SARS-CoV-2 การวิจัยนี้มีวัตถุประสงคเพื่อศึกษาวาสมุนไพรไทยอาจมีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อไวรัสดังกลาว จึงไดคัดกรองฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 ในหลอดทดลองดวยวิธี plaque reduction assay ของพืชสมุนไพรบางชนิดที่มีสรรพคุณลดไขในตํารับยาแผนไทย โดยสาร สกัดที่มีฤทธิ์ตานไวรัสจะถูกนํามาศึกษาปฏิกิริยายับยั้งเอนไซม ACE2 และทดสอบการแสดงออกของยีนในเซลลปอดเพาะเลี้ยง ผลการวิจัยพบวาสารสกัดดวยน้ําของสมุนไพรแมงลักคา (HSF, HSD) และปอบิด (HID) ที่ความเขมขนสูงสุด 5, 5 และ 10 mg/mL มีฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 ได 100, 100 และ 99.49% ตามลําดับ rosmarinic acid (RA) ซึ่งเปนสารพฤกษเคมี ชนิดหนึ่งในสมุนไพรแมงลักคาและปอบิดที่ความเขมขน 0.625 mg/mL มีฤทธิ์ตานไวรัสที่ 94.49% และยับยั้งเอนไซม ACE2 สูงสุดที่ 70.25% ที่ความเขมขน 100 µg/mL ซึ่งไมเปนพิษตอเซลล ในขณะที่สารสกัดสมุนไพรอื่นมีคาการยับยั้ง นอยกวา ซึ่ง RA ลดการแสดงออกของยีน ACE2 และ TMPRSS2 แตไมลดการแสดงออกของ PIKfyve หรือ cathepsin L ใน Calu-3 cells จึงสามารถสรุปไดวา HSF, HSD, HID และ RA มีฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 ซึ่ง RA ในสมุนไพรอาจ ลดการแพรกระจายไวรัสในระยะแรกของการติดเชื้อได ดังนั้นควรมีการศึกษาฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2 ของสารสกัดดังกลาว ในสัตวทดลองและทางคลินิกเพื่อพัฒนาเปนยาสมุนไพรตานไวรัสตอไป คําสําคัญ: ฤทธิ์ตาน SARS-CoV-2, ฤทธิ์ยับยั้ง ACE2, โมเลกุลเปาหมาย, โควิด 19

นิพนธตนฉบับ ว กรมวิทย พ 2565; 64 (2): 106-120 106 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 เสาวณีย วาจาสิทธิ์ สุวิมล หมวดหมะ อัจฉรี อินแกว กัญญารัตน เชื้อกูลชาติ วิทวัส วังแกวหิรัญ สกุลรัตน สมสันติสุข และ ทองสุข ปายะนันทน สำนักคุณภาพและความปลอดภัยอาหาร กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000 การพัฒนาและทดสอบความถูกตองของวิธีวิเคราะห สารตกคางคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และ พาราควอต ในผักและผลไมโดยเทคนิค LC-MS/MS บทคัดยอ จากสถิติการนําเขาสารเคมี กลุม herbicides สารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต พบวามีการนํา มาใชในการกําจัดวัชพืชทางการเกษตร โดยไดควอตและพาราควอตเปนสารกําจัดวัชพืชที่ใชฉีดพนในพืชไร สวนคลอรมีควอตและ เมพิควอตเปนสารสังเคราะหควบคุมการเจริญเติบโตของพืช ผลของการใชสารเหลานี้อยางไมเหมาะสม โดยเฉพาะพาราควอต กอใหเกิดการตกคางในสิ่งแวดลอม และอาจกระทบตอความปลอดภัยของผูบริโภค องคการอนามัยโลกไดจัดใหพิษของพาราควอต อยูใน class II คือ มีพิษปานกลางและตามพระราชบัญญัติวัตถุอันตราย พ.ศ. 2563 จัดเปนวัตถุอันตรายชนิดที่ 4 งานวิจัยนี้ จึงไดพัฒนาและทดสอบความถูกตองของวิธีวิเคราะหสารทั้ง 4 ชนิด ในผักและผลไม ซึ่งสารจะถูกสกัดดวย acidifi ed methanol แลวนําไปปนแยกสวน กอนนําไปตรวจวิเคราะหชนิดและปริมาณดวย LC-MS/MS โดยสารทั้ง 4 ชนิด มีคา limit of detection และ limit of quantitation เทากับ 0.005 และ 0.010 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ตามลําดับ ชวงการวิเคราะหที่ใหความสัมพันธ เปนเสนตรงอยูในชวง 0.01–0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม คาความแมนอยูในชวง 66.1–117.2% และคาความเที่ยงอยูระหวาง 0.4–14.5% พรอมทั้งวิธีนี้ไดรับการรับรองความสามารถหองปฏิบัติการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2017 ในป พ.ศ. 2563 จึงมีความเหมาะสมที่จะนําวิธีนี้มาใชในการตรวจวิเคราะหทางหองปฏิบัติการ เพื่อการคุมครองผูบริโภคและดําเนินการ ตามกฎหมายตอไป นอกจากนี้ไดทําการสํารวจการตกคางของสารกลุมนี้ในผักและผลไมสดในป 2563 จํานวน 219 ตัวอยาง ผลตรวจพบ 3 ตัวอยาง ซึ่งเปนเมพิควอต 2 ตัวอยาง และคลอรมีควอต 1 ตัวอยาง และทุกตัวอยางตรวจไมพบพาราควอต คําสําคัญ: คลอรมีควอต, ไดควอต, เมพิควอต, พาราควอต, ผักและผลไม Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 19 October 2022 Revised: 6 May 2022 Accepted: 19 May 2022

] double charge นอกจากนี้ยังมีวิธีวิเคราะหสำหรับพาราควอต

108 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Determination of Chlormequat, Diquat, Mepiquat, and Paraquat in Vegetables and Fruits Saovanee Wajasit et al. และไดควอต โดยใช isotope labeling standard เพื่อ ใหได robustness และ accuracy ดีขึ้น(13,14) ปจจุบัน วิธีการสกัดและการตรวจวิเคราะหสารกลุมที่มีขั้วสูง อีกวิธีหนึ่งที่นิยมใช คือ QuPPe-Method ซึ่งพัฒนา โดย EURL-SRM เนื่องจากมีความเฉพาะเจาะจงกับสาร กลุมนี้ อีกทั้งยังสามารถวิเคราะหพรอมกันไดหลายชนิด ในหนึ่งวิธีดวยเทคนิค LC-MS/MS โดยมี detector เปนชนิด triple quadrupole ซึ่งเปนเทคนิคที่สามารถ วิเคราะหหาปริมาณสารตกคางในระดับต่ำ ทั้งนี้ขึ้นอยู กับการเลือกใช interface ที่ทำหนาที่เปนแหลงกำเนิด ไอออน (ion source) ใหเหมาะสมกับสภาพขั้วของสาร (polar compounds)(15) เพื่อควบคุมคุณภาพอาหารตามกฎหมายไทยที่ ใหยกเลิกการใชพาราควอตและเพื่อทราบสถานการณ การตกคาง ตลอดจนใชเปนขอมูลพื้นฐานในการวางแผน ดำเนินการทางกฎหมายใหกับหนวยงานที่เกี่ยวของ คณะ ผูวิจัยจึงไดศึกษาพัฒนาวิธีวิเคราะหที่สามารถวิเคราะห สารทั้ง 4 ชนิด ไดแก คลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในตัวอยางผักและผลไมสดไดพรอมกัน ในครั้งเดียว ทั้งนี้สามารถเตรียมตัวอยางไดรวดเร็ว ใช ปริมาณสารเคมีนอย ประหยัดคาใชจาย โดยใชเทคนิค LC-MS/MS ซึ่งเปนเทคนิคที่มีความไวและความ จำเพาะสูง สามารถตรวจสอบสารที่มีปริมาณนอยไดอยาง แมนยำ โดยใชคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล เปนตัวแทนของ matrix ผักและผลไม วัสดุและวิธีการ สารเคมีและสารมาตรฐาน สารมาตรฐาน: paraquat dichloride, diquat dibromide, mepiquat chloride และ chlormequat chloride ทั้งหมดเปนผลิตภัณฑของ Dr. Ehrenstorfer ความบริสุทธิ์ > 98% (บริษัทผูผลิต LGC labor GmbH, ประทศเยอรมัน) สารเคมี: methanol (MeOH), acetonitrile (CH3CN) เปน HPLC grade, formic acid, ammomium formate (NH4HCO2) เปน AR grade, acidified methanol เตรียมโดยปเปต formic acid 1.0 มิลลิลิตร ลงใน volumetric flask ที่มี MeOH และปรับปริมาตรเปน 100 มิลลิลิตร ดวย MeOH การเตรียมสารละลายมาตรฐาน สารละลายมาตรฐาน stock solution ความเขมขน 1,000 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร โดยชั่งสารมาตรฐาน แตละชนิด 10 มิลลิกรัม ละลายและปรับปริมาตรเปน 10 มิลลิลิตร ดวย MeOH คำนวณความเขมขนของสาร มาตรฐานเปาหมาย และเตรียมสารละลายมาตรฐานผสม ความเขมขน 100, 10 และ 1 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร ดวย acidified methanol: H2O (1:1) เครื่องมือและอุปกรณ เครื่องชั่งความละเอียด 0.001 กรัม และ 0.01 มิลลิกรัม, refrigerated centrifuge, vortex mixer, เครื่องบดปนตัวอยาง, micro pipette ขนาด 2–20, 10–200, 20–200 และ 100–1,000 ไมโครลิตร, screw cap centrifuge tube ขนาด 50 มิลลิลิตร, micro-spin filter tube 0.45 µm nylon, volumetric flask ชนิด polypropylene ขนาด 10 มิลลิลิตร, vial สีชาชนิด polypropylene ขนาด 1.5 มิลลิลิตร, เครื่อง LC-MS/ MS ประกอบดวย HPLC รุน Agilent 1260 series (บริษัทเอจิเลนต เทคโนโลยี, ประเทศสิงคโปร), MS/MS detector ชนิด triple quadrupole mass spectrometer รุน 5500 QTRAP (บริษัท AB SCIEX, ประเทศแคนดา) และ column: Atlantis® HILIC Silica (2.1 mm × 150 mm, 3µm) การเตรียมตัวอยาง การทดสอบความถูกตองของวิธีวิเคราะห ใช ตัวอยางคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล เปนตัวแทนกลุมผักและผลไม (representative matrix) การสำรวจปริมาณการตกคางของสารทั้ง 4 ชนิด ในป พ.ศ. 2563 รวมทั้งสิ้น 219 ตัวอยาง แบงออกเปน ตัวอยางจากแหลงกระจายสินคาทั่วประเทศทั้ง 77 จังหวัด จำนวนทั้งสิ้น 65 ตัวอยาง แบงเปนผัก 51 ตัวอยาง และ ผลไม 14 ตัวอยาง และตัวอยางจากโครงการสำรวจผัก และผลไมสด ซึ่งเปนวัตถุดิบในการประกอบอาหารของ โรงพยาบาล เก็บตัวอยางจากโรงพยาบาลทั้งขนาดเล็กและ ขนาดใหญครอบคลุมพื้นที่ 12 เขตสุขภาพ จำนวน 154 ตัวอยาง แบงเปนผัก 100 ตัวอยาง และผลไม 54 ตัวอยาง

109 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การวิเคราะหสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในผักและผลไม เสาวณีย วาจาสิทธิ์ และคณะ หลักการการวิเคราะห นำผักและผลไมบดละเอียดมาเติมน้ำกลั่น จากนั้น สกัดสารตกคางทั้ง 4 ชนิด จากตัวอยางดวย acidified methanol โดยเขยาตอเนื่องใน water bath ที่อุณหภูมิ 80±2 องศาเซลเซียส แลวนำมาตกตะกอนโดยการ centrifuge ดูดสวนใสใส micro spin และนำไป centrifuge เพื่อกรองสวนใสอีกรอบ จากนั้นนำสารที่ สกัดตรวจหาชนิดและปริมาณโดยเทคนิค LC-MS/MS คำนวณปริมาณจาก calibration curve ที่ plot ระหวาง concentration กับ peak area ของสารมาตรฐาน วิธีการตรวจวิเคราะห การสกัดและการทำใหบริสุทธิ์ (extraction and clean up) ชั่งตัวอยาง 10.0 กรัม ลงใน screw cap centrifuge tube ขนาด 50 มิลลิลิตร เติมน้ำกลั่นใหครบ 100% ของ คาความชื้นของตัวอยาง(15) (ตัวอยางเชน ผักกาดขาว มี ความชื้นรอยละ 96.6 ถาชั่งตัวอยางผักกาดขาว 10 กรัม ที่ใชในการวิเคราะห จะมีปริมาตรน้ำเทากับ ((96.6 × 10) /100) = 9.66 กรัม ดังนั้นปริมาตรของน้ำกลั่นที่เติมเทากับ 10–9.66 เทากับ 340 ไมโครลิตร หรือ 0.34 มิลลิลิตร) ปนดวย vortex mixer เปนเวลา 1 นาที เติม acidified methanol 10 มิลลิลิตร ปนดวย vortex mixer เปน เวลา 1 นาที เขยาตอเนื่องใน water bath ที่อุณหภูมิ 80±2 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15 นาที วางทิ้งใหเย็นที่ อุณหภูมิหอง จากนั้นนำไป centrifuge ความเร็ว 3,000 รอบตอนาที ที่ -10 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที ดูดสารละลายสวนใส 1 มิลลิลิตร ใสหลอด micro-spin filters นำไป centrifuge ความเร็ว 10,000 รอบตอนาที ที่ -10 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที เทสารละลายที่ กรองไดใสใน vials พลาสติกสีชา นำไปตรวจวัดชนิดและ ปริมาณดวยเครื่อง LC-MS/MS การตรวจวัดชนิดและปริมาณ เครื่อง Agilent 1260 series 5500 QTRAP MS/MS: มีสภาวะดังนี้ mobile phase: 20 mM ammonium formate และ CH3CN ใชโปรแกรม gradient ในการแยกสาร เวลาที่ใชในการวิเคราะห ทั้งหมด 24 นาที โดยมีสภาวะของ mass spectrometer ประกอบดวย ion spray voltage: 4500 volts, temperature (TEM): 500 องศาเซลเซียส, collision gas (CAD): nitrogen; medium, curtain gas (CUR): 23 psig, ion spray nebulizer gas (GAS-1) : 50 psig และ TIS heater gas (GAS-2): 60 psig โดยสารจะถูกทำใหเปนไอออนบวกดวย electro spray ionization (ESI) ไอออนที่ไดจะถูกวิเคราะหดวย multiple reaction monitoring (MRM) โดยศึกษา mass ที่ m/z ดังแสดงในตารางที่ 1 ตารางที่ 1 MS/MS acquisition parameters ของการวิเคราะหคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต chlormequat 122.0 58.0 (primary) 148.46 7.07 36.65 7.06 122.0 63.0 (secondary) 148.46 7.07 27.11 10.40 diquat 183.3 168.0 (primary) 81.20 13.10 30.82 10.32 183.3 157.1 (secondary) 81.20 13.10 22.00 9.79 mepiquat 114.2 98.0 (primary) 254.96 7.84 34.09 13.57 114.2 58.0 (secondary) 254.96 7.84 32.53 9.17 paraquat 186.3 171.1 (primary) 80.00 11.69 28.00 11.80 171.1 77.0 (secondary) 156.30 8.00 46.65 9.24 precursor ion product ion DP EP CE CXP component (m/z) (m/z) (eV) (eV) (eV) (eV)

b ปริมาณสารที่ตรวจพบ × (มิลลิกรัมตอกิโลกรัม) เทากับ (Y-b)/a โดย Y คือ พื้นที่ใตพีคของสารมาตรฐาน, a คือ ความชันของกราฟมาตรฐาน และ b คือ จุดตัดแกน Y การทดสอบความถูกตองของวิธีวิเคราะห (method validation) การทดสอบความจำเพาะเจาะจง (specificity) ตรวจสอบ specificity โดยพิจารณาจาก ion ratio และ retention time ของสารละลายตัวอยางตอง ไมแตกตางจาก ion ratio และ retention time เฉลี่ย ของสารมาตรฐานเกินเกณฑการยอมรับ ซึ่ง retention time ของสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และ พาราควอต ในตัวอยางแตกตางจากสารมาตรฐานได ไมเกิน 2%(16) การสรางกราฟมาตรฐาน (calibration curve) เตรียม procedural mixed standard calibration curve โดยชั่ง matrix blank จำนวน 6 หลอด แลวเติมสารมาตรฐานที่ระดับความเขมขน 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.10 และ 0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม จาก นั้นทำการสกัดและทำใหบริสุทธิ์เหมือนการสกัดตัวอยาง สรางกราฟมาตรฐานระหวาง (แกน x) ความเขมขนของ สารมาตรฐาน กับ (แกน y) พื้นที่ใตพีคของสารมาตรฐาน คำนวณหาสัมประสิทธิ์สหสัมพันธของเปยรสัน (pearson correlation coefficient: r) สัมประสิทธิ์การตัดสินใจ (coefficient of determination: R2 ) การวิเคราะห method blank และ matrix blank method blank สกัดและวิเคราะหตามวิธีที่พัฒนา โดยใชสารเคมีทั้งหมด แตไมมีตัวอยางสำหรับ matrix blank ที่ใชจะครอบคลุมตัวอยางที่ใชตรวจสอบความ ถูกตองของวิธี ซึ่งประกอบดวยตัวอยางคะนา ตำลึง ผัก กาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล สกัดและ วิเคราะหตามวิธีที่พัฒนา จากนั้นฉีดสารสกัด method blank และ matrix blank เขาเครื่อง LC-MS/MS เพื่อตรวจสอบวามี mass หรือสัญญาณรบกวนตรงสาร มาตรฐานหรือไม เพื่อปองกันความผิดพลาดของผล วิเคราะห การหาขีดจำกัดของการตรวจพบ (limit of detection: LOD) กำหนดคา LOD โดยใชคา 0.005 มิลลิกรัมตอ กิโลกรัม ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่ 419 พ.ศ. 2563 เรื่อง อาหารที่มีสารพิษตกคาง (ฉบับที่ 3) ทดสอบคา LOD โดยเติมสารมาตรฐานลงใน matrix blank ที่ระดับความเขมขน 0.005 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม จากนั้นยืนยันคา LOD โดยทำการทดสอบไมนอยกวา 6 ซ้ำ ผลตองไมพบ false negative และตองใหสัญญาณ คา signal/noise > 3 การหาขีดจำกัดของการวัดเชิงปริมาณ (limit of quantitation: LOQ) กำหนดคา LOQ โดยใชคา default limit (0.01 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม) ตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่ 387 พ.ศ. 2560 เรื่อง อาหารที่มีสารพิษตกคาง เนื่องจากคาอางอิง (target value) ของสารมีคาแตกตาง กันในแตละชนิดพืช ดังนั้นจึงยืนยันคา LOQ โดยเติมสาร มาตรฐานที่ระดับความเขมขน 0.01 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ลงใน matrix blank วิเคราะหไมนอยกวา 6 ซ้ำ คำนวณ %recovery กำหนดเกณฑยอมรับอยูในชวง 60–120, %RSD(17) และ HORRAT (Horwitz ratio) กำหนด เกณฑยอมรับตาม Codex และ EU มีคา ≤ 2 จากสมการ HORRAT = Experimental RSDr Predicted RSDr การทดสอบความเปนเสนตรงและชวงการ วิเคราะห (linearity and working range) เติมสารมาตรฐานทั้ง 4 ชนิด ลงใน matrix blank ที่ ระดับความเขมขน 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.10 และ 0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม วิเคราะหระดับละ 3 ซ้ำ สรางกราฟ ความสัมพันธระหวางความเขมขนที่เติมกับคาเฉลี่ยความ เขมขนที่ตรวจพบ คำนวณหาสัมประสิทธิ์การตัดสินใจ (coefficient of determination: R2 )

111 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การวิเคราะหสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในผักและผลไม เสาวณีย วาจาสิทธิ์ และคณะ การทดสอบความแมน (accuracy) และ ความเที่ยง (precision) ทดสอบโดยเติมสารมาตรฐานทั้ง 4 ชนิด ลงใน matrix blank ที่ระดับความเขมขน 0.01, 0.05 และ 0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม วิเคราะหระดับละไมนอยกวา 6 ซ้ำ คำนวณปริมาณเทียบกับสารมาตรฐาน แลวคำนวณ คาเฉลี่ย %recovery, %RSD และ HORRAT โดยเกณฑ ยอมรับความแมน: mean recovery 60–120% เกณฑ ยอมรับความเที่ยง: HORRAT ≤ 2 การประมาณคาความไมแนนอนของการวิเคราะห (uncertainty) การประมาณคาความไมแนนอนของการวัด(18) โดยคำนึงถึงแหลงของความไมแนนอนทุกแหลงรวมคา ความไมแนนอนทั้งหมด แลวคำนวณคาความไมแนนอน ขยายที่ระดับความเชื่อมั่น 95% ในการประเมินคาความ ไมแนนอนของการวิเคราะหตามวิธีที่ไดทดสอบ ปริมาณ สารที่พบหนวยเปนมิลลิกรัมตอกิโลกรัม (mg/kg) โดย คำนวณความเขมขนของสารที่ตรวจพบจาก calibration curve ผล จากการศึกษาการตรวจวิเคราะหสารทั้ง 4 ชนิด ไดแก คลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ภายใตสภาวะที่กำหนด สามารถสรางกราฟมาตรฐาน procedural mixed standard calibration curve ซึ่งเปนการเติมสารมาตรฐานที่ความเขมขนระดับตางๆ ลงใน matrix blank และทำการสกัดตามขั้นตอน การวิเคราะหเชนเดียวกับตัวอยาง เปนการชดเชย ผลกระทบจากลักษณะตัวอยางและชดเชยการสูญหายของ สารที่สนใจที่อาจเกิดขึ้นในขั้นตอนการสกัดได โดยแสดง ความสัมพันธระหวางความเขมขนที่เติมกับคาพื้นที่ใต กราฟ สามารถวิเคราะหสารดังกลาวไดในชวงความเขมขน 0.01–0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ไดกราฟที่เปนเสนตรง โดยคา R2 อยูในชวง 0.975–0.999 เมื่อวิเคราะห method blank ของสารเคมีที่ใชทั้งหมด และ matrix blank ของตัวอยางคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล ไมพบสัญญาณรบกวนใน ชวงของการตรวจวัดสารเปาหมาย ผลการตรวจสอบ specificity คา ion ratio และ retention time ของสารละลายตัวอยางไมแตกตางจาก ion ratio และ retention time เฉลี่ยของสารมาตรฐาน โดยยังอยูในเกณฑการยอมรับ และ retention time ของ สารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต คือ คาจากตัวอยางแตกตางจากสารมาตรฐานไมเกิน 2% ดังแสดงในภาพที่ 1 ผลการทดสอบขีดจำกัดของการตรวจพบ (LOD) เทากับ 0.005 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม โดยใหสัญญาณพีค มีคาสูงกวา 3 เทาของ signal to noise สวนคาขีดจำกัด ของการวัดเชิงปริมาณ (LOQ) เทากับ 0.01 มิลลิกรัม ตอกิโลกรัม ในทุกชนิดสาร ผลการพิสูจนคา LOQ โดย การเติมสารมาตรฐาน วิเคราะห 6 ซ้ำ ใชตัวอยางคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล ไดคา mean recovery ในชวง 69.2–114.4%, HORRAT ในชวง < 0.1–0.6 ดังแสดงในตารางที่ 2 ผลการทดสอบชวงของการวัด (working range) และความเปนเสนตรง (linearity) จากกราฟความ สัมพันธระหวางความเขมขนที่เติมกับคาเฉลี่ยความเขมขน ที่ตรวจพบ ในชวง 0.01–0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ไดคา R2 ระหวาง 0.975–0.999 ดังแสดงในตารางที่ 3

112 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Determination of Chlormequat, Diquat, Mepiquat, and Paraquat in Vegetables and Fruits Saovanee Wajasit et al. ตารางที่ 2 ผลการทดสอบคา mean recovery, %RSD และ HORRAT ที่ระดับความเขมขน 0.01 มิลลิกรัม ตอกิโลกรัม ของสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในตัวอยางคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล ชนิด ตัวอยาง chlormequat diquat mepiquat paraquat %Rec. %RSD HORRAT %Rec. %RSD %Rec. %RSD %Rec. %RSD คะนา 112.8 4.2 0.2 74.3 9.9 0.5 92.9 8.8 0.4 73.4 11.4 0.5 ตำลึง 100.4 0.5 < 0.1 105.9 5.2 0.2 100.6 2.5 0.1 77.3 10.4 0.5 ผักกาดขาว 96.5 13.1 0.6 89.5 10.2 0.5 100.9 2.0 0.1 69.2 4.1 0.2 หัวไชเทา 100.9 8.6 0.4 104.4 7.8 0.4 108.4 7.7 0.4 108.8 3.9 0.2 มะเขือเทศ 92.3 4.0 0.2 106.8 6.7 0.3 93.5 1.7 0.1 90.3 9.7 0.5 สม 99.6 1.6 0.1 76.6 10.0 0.5 90.8 5.5 0.3 83.4 3.5 0.2 แอปเปล 99.6 3.6 0.2 110.9 4.8 0.2 114.4 1.8 0.1 89.3 9.3 0.4 ตารางที่ 3 ความเปนเสนตรง ที่ชวงความเขมขน 0.01–0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ชนิดตัวอยาง R2 chlormequat diquat mepiquat paraquat คะนา 0.988 0.986 0.999 0.990 ตําลึง 0.987 0.984 0.990 0.994 ผักกาดขาว 0.999 0.999 0.989 0.975 หัวไชเทา 0.993 0.989 0.991 0.991 มะเขือเทศ 0.976 0.998 0.988 0.997 สม 0.996 0.996 0.999 0.994 แอปเปล 0.999 0.998 0.999 0.998 HORRAT HORRAT HORRAT ภาพที่ 1 โครมาโตแกรมของสารมาตรฐาน และ blank ที่ m/z 186/171 (พาราควอต), m/z 183/168 (ไดควอต), m/z 122/58 (คลอรมีควอต) และ m/z 114/98 (เมพิควอต)

113 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การวิเคราะหสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในผักและผลไม เสาวณีย วาจาสิทธิ์ และคณะ การทดสอบคาความแมนและความเที่ยงของวิธี วิเคราะหที่ระดับความเขมขน 0.01, 0.05 และ 0.20 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม วิเคราะหระดับละ 6 ซ้ำ พบวา ความแมนที่ประเมินจาก %recovery เฉลี่ยทั้ง 3 ระดับ อยูในชวง 66.1–117.2% และความเที่ยง (precision) ที่ประเมินดวย %RSD และ HORRAT อยูในชวง 0.4–14.5 และ < 0.1–1.0 ดังแสดงในตารางที่ 4 ตารางที่ 4 ผลการทดสอบ %recovery และความเที่ยงในการวิเคราะห ของสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในตัวอยางคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล คะนา chlormequat 0.01 112.8 ±0.5 4.2 0.2 0.05 82.0 ±0.3 0.7 < 0.1 0.20 86.0 ±16.7 9.7 0.7 diquat 0.01 74.3 ±0.7 9.9 0.5 0.05 73.5 ±0.7 1.8 0.1 0.20 80.8 ±6.4 4.2 0.3 mepiquat 0.01 92.9 ±0.8 8.8 0.4 0.05 100.1 ±0.6 1.2 0.1 0.20 113.5 ±7.1 3.1 0.2 paraquat 0.01 73.4 ±0.8 11.4 0.5 0.05 80.2 ±0.6 1.5 0.1 0.20 102.0 ±8.4 4.1 0.3 ตำลึง chlormequat 0.01 100.4 ±0.1 0.5 < 0.1 0.05 101.9 ±4.7 9.1 0.6 0.20 88.4 ±7.2 4.1 0.3 diquat 0.01 105.9 ±0.6 5.2 0.2 0.05 94.3 ±5.6 11.9 0.7 0.20 76.7 ±18.6 11.7 0.9 mepiquat 0.01 100.6 ±0.3 2.5 0.1 0.05 93.1 ±6.7 14.5 0.9 0.20 86.3 ±8.3 4.8 0.4 paraquat 0.01 77.3 ±0.8 10.4 0.5 0.05 85.8 ±9.8 8.5 0.6 0.20 88.7 ±15.2 8.5 0.6 ผักกาดขาว chlormequat 0.01 96.5 ±1.3 13.1 0.6 0.05 91.4 ±4.0 8.8 0.5 0.20 100.2 ±0.5 0.5 < 0.1 diquat 0.01 89.5 ±0.9 10.2 0.5 0.05 100.0 ±4.1 8.3 0.5 0.20 97.2 ±7.6 3.9 0.3 mepiquat 0.01 100.9 ±0.2 2.0 0.1 0.05 92.5 ±4.3 9.3 0.6 0.20 93.4 ±5.7 3.0 0.2 Spiked level Sample type compound Mean Rec. ± SD %RSD HORRAT (mg/kg)

114 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Determination of Chlormequat, Diquat, Mepiquat, and Paraquat in Vegetables and Fruits Saovanee Wajasit et al. ตารางที่ 4 ผลการทดสอบ %recovery และความเที่ยงในการวิเคราะห ของสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในตัวอยางคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล (ตอ) ผักกาดขาว paraquat 0.01 69.2 ±0.3 4.1 0.2 (ตอ) 0.05 100.7 ±1.2 2.4 0.1 0.20 97.5 ±4.8 2.5 0.2 หัวไชเทา chlormequat 0.01 100.9 ±0.9 8.6 0.4 0.05 91.2 ±0.3 0.8 < 0.1 0.20 104.2 ±2.9 1.4 0.1 diquat 0.01 104.4 ±0.8 7.8 0.4 0.05 95.1 ±1.0 2.0 0.1 0.20 107.2 ±5.9 2.7 0.2 mepiquat 0.01 108.4 ±0.8 7.7 0.4 0.05 96.2 ±0.3 0.7 < 0.1 0.20 115.5 ±3.4 1.5 0.1 paraquat 0.01 108.8 ±0.4 3.9 0.2 0.05 93.5 ±0.2 0.4 < 0.1 0.20 107.3 ±3.0 1.4 0.1 มะเขือเทศ chlormequat 0.01 92.3 ±0.4 4.0 0.2 0.05 102.8 ±1.4 2.7 0.2 0.20 94.8 ±1.6 0.9 0.1 diquat 0.01 106.8 ±0.7 6.7 0.3 0.05 117.2 ±1.0 1.7 0.1 0.20 96.5 ±12.1 6.3 0.5 mepiquat 0.01 93.5 ±0.2 1.7 0.1 0.05 100.8 ±0.3 0.6 < 0.1 0.20 97.0 ±1.3 0.7 0.1 paraquat 0.01 90.3 ±0.9 9.7 0.5 0.05 105.2 ±2.5 4.8 0.3 0.20 82.2 ±6.0 3.7 0.3 สม chlormequat 0.01 99.6 ±0.2 1.6 0.1 0.05 110.1 ±0.8 0.7 < 0.1 0.20 73.4 ±19.6 13.3 1.0 diquat 0.01 76.6 ±0.8 10.0 0.5 0.05 103.6 ±2.4 4.6 0.3 0.20 86.9 ±16.9 3.7 0.3 mepiquat 0.01 90.8 ±0.5 5.5 0.3 0.05 107.0 ±0.9 1.7 0.1 0.20 66.1 ±5.9 4.5 0.3 paraquat 0.01 83.4 ±0.3 3.5 0.2 0.05 102.2 ±2.1 4.0 0.2 0.20 91.1 ±23.8 13.1 1.0 Spiked level Sample type compound Mean Rec. ± SD %RSD HORRAT (mg/kg)

115 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การวิเคราะหสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในผักและผลไม เสาวณีย วาจาสิทธิ์ และคณะ ตารางที่ 4 ผลการทดสอบ %recovery และความเที่ยงในการวิเคราะห ของสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในตัวอยางคะนา ตำลึง ผักกาดขาว หัวไชเทา มะเขือเทศ สม และแอปเปล (ตอ) จากการประมาณคาความไมแนนอนของการ วิเคราะหตามวิธีที่ไดทดสอบ โดยนำการวิเคราะหสาร พาราควอตในสมเปนตัวแทนการคำนวณ พบแหลงที่มา ของความไมแนนอน ไดแก การชั่งน้ำหนักของตัวอยาง (sample weight: Ms) เครื่องแกววัดปริมาตรที่ใช (sample volume: Vs) คา concentration ที่อาน ไดจาก calibration curve และจากการเตรียมสาร มาตรฐาน (concentration of sample: Cs) bias และ precision คำนวณคาความไมแนนอนของสารพาราควอต พบวามีคาเทากับ ±26.2% ที่ระดับความเชื่อมั่น 95% และเมื่อเปรียบเทียบสัดสวนคาความไมแนนอนจากแหลง ความไมแนนอน ที่สงผลตอปริมาณสารจากมากไปหานอย ไดแก ความเที่ยงของวิธีวิเคราะห (method precision, 58%) concentration ที่อานไดจาก calibration curve และจากการเตรียมสารมาตรฐาน (concentration of sample, 28%) ความเบี่ยงแบนจากคาจริง (bias, 10%) การชั่งน้ำหนักของตัวอยาง (sample weight, 3%) และ จากเครื่องแกววัดปริมาตรที่ใช (sample volume, 1%) ดังแสดงในภาพที่ 2 ภาพที่ 2 สัดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวิเคราะหสารพาราควอตในตัวอยางสม Spiked level Sample type compound Mean Rec. ± SD %RSD HORRAT (mg/kg) แอปเปล chlormequat 0.01 99.6 ±0.4 3.6 0.2 0.05 86.9 ±0.7 1.6 0.1 0.20 90.6 ±5.2 2.9 0.2 diquat 0.01 110.9 ±0.5 4.8 0.2 0.05 100.8 ±1.9 3.7 0.2 0.20 107.7 ±3.5 1.6 0.1 mepiquat 0.01 114.4 ±0.2 1.8 0.1 0.05 97.3 ±0.6 1.3 0.1 0.20 103.4 ±3.3 1.6 0.1 paraquat 0.01 89.3 ±0.8 9.3 0.4 0.05 106.7 ±2.1 3.9 0.2 0.20 112.0 ±6.9 3.1 0.2

] ที่ m/z 122.0, 114.2 และ 186.3 ตามลำดับเปน precursor ion เลือกคู product ion ที่ m/z 58.0 กับ 63.0, 98.0 กับ 58.0 และ 171.1 กับ 77.0 ตามลำดับ สำหรับสภาวะเครื่อง LC ผูวิจัยไดปรับจากวิธีของ QuPPe-Method โดยใชโปรแกรม double gradient ในการแยกสาร ทำใหใชเวลาในการตรวจวิเคราะหเพิ่มจาก 12 นาที เปน 24 นาที เพื่อปองกันการเกิด carry over ในระบบ และใช column ชนิด hydrophilic interaction (HILIC) มี particle shape เปนแบบ spherical ซึ่ง มีความพิเศษสามารถทำงาน 2 รูปแบบ ผสมผสานกัน (difunctional bonded) ระหวาง silica-based C18 ซึ่งเปน reversed-phase กับ normal phase ทำใหมี ความจำเพาะในการหนวงสารที่มีคุณสมบัติ HPH อยูใน column ไดนาน ทำให retention time ของสารเปาหมาย มีความเหมาะสม ไมออกเร็วเกินไป สวนวิธีการสกัด

117 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การวิเคราะหสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในผักและผลไม เสาวณีย วาจาสิทธิ์ และคณะ ผูวิจัยใชวิธีของ QuPPe-Method Version 8.1 โดย ปจจัยหลักที่ตองควบคุมสำหรับขั้นตอนการสกัด คือ สภาวะความชื้นของตัวอยาง ซึ่งตองเติมน้ำใหครบ 100% ของชนิดตัวอยาง โดยคำนวณปริมาตรน้ำที่ตองเติม และ สกัดภายใตสภาวะอุณหภูมิ 80±2 องศาเซลเซียส นอกจากนี้ พบวาการสกัดวิธีนี้ทำใหสารบริสุทธิ์กอนการฉีดเขาเครื่อง มีเพียงการตกตะกอนดวยเครื่อง centrifuge และใช micro-spin filters ชวยในการกรองตะกอนเทานั้น ทั้งนี้ผูวิจัยพบวาตัวอยางผักและผลไมมี matrix หลากหลาย ทั้งประเภทคลอโรฟลสูงน้ำตาลสูง ดังนั้น การตกตะกอนดวยอุณหภูมิหองไมสามารถกำจัด สิ่งรบกวนออกไดทั้งหมด ทำใหรบกวนผล ดังนั้น การวิเคราะหจึงไดทดลองปรับสภาวะอุณหภูมิขณะ ตกตะกอนดวยเครื่อง centrifuge ในทุกขั้นตอนเปน อุณหภูมิ -10 องศาเซียลเซส พบวาชวยทำใหสารสกัด ในทุกขั้นตอนใส กำจัดสิ่งรบกวนไดดี สัญญาณพีคที่ ตรวจพบชัดเจน งายตอการประเมินผลวิเคราะห ในการ วิเคราะหยังไดกำหนดการควบคุมคุณภาพเพื่อใหไดผล ที่ถูกตอง ไดแก การเลือก identification point ซึ่ง เปนระบบการคิดคะแนน เพื่อการยืนยันชนิดสารในการ แปลผลขอมูล โดยใชจำนวน parent ion เริ่มตน และ daughter ion รวมทั้งกำหนดความแตกตางสูงสุด ที่ยอมรับได (maximum permitted tolerance) ของ relative ion intensities ตามที่ European Communities (EC) กำหนด(16) นอกจากนี้คา precision ที่ไดมีคาสัมประสิทธิ์ความแปรปรวน (%RSD) อยู ในชวง 0.4–14.5 โดยมีคา HORRAT < 2 ซึ่งเปนไป ตามเกณฑของที่ Codex กำหนดไว นอกจากนี้ยังได มีการวางแผนการควบคุมคุณภาพภายใน (internal quality control) เพื่อความมั่นใจในผลการวิเคราะห ตัวอยางทุก batch โดยกำหนดไวไมเกิน 10 ตัวอยาง ทำการทดสอบ method blank, matrix blank, duplicate analysis และ spiked sample ในการ ทดสอบความถูกตองของวิธีวิเคราะหที่พัฒนาขึ้นนี้ ไมไดใชวัสดุอางอิงรับรอง (certified reference materials: CRM) ในการประกันคุณภาพของผลการ ทดสอบและตรวจสอบความถูกตองของวิธีทดสอบ แตใช การเติม (spiking) สารมาตรฐานลงใน matrix blank แทน อยางไรก็ตามหองปฏิบัติการมีการควบคุมคุณภาพ เพื่อเฝาระวังความใชไดของการทดสอบ โดยเขารวม โปรแกรมการทดสอบความชำนาญ การเปรียบเทียบผล การวิเคราะหระหวางหองปฏิบัติการในตัวอยางขาวโอต 09130 จัดโดย FAPAS รอบระหวางเดือนเมษายน– มิถุนายน 2563 พบวาผลการประเมินอยูในเกณฑยอมรับ ได (|Z| < 2) โดยคลอรมีควอตและเมพิควอต มีคา Z score เทากับ 0.9 และ -0.1 ตามลำดับ ในป พ.ศ. 2563 วิธีตรวจวิเคราะหนี้ไดรับการรับรองความสามารถ หองปฏิบัติการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2017 จากสำนักมาตรฐานหองปฏิบัติการ แสดงใหเห็นวาวิธีที่ ไดทดสอบนี้มีความเหมาะสมในการใชวิเคราะหสารทั้ง 4 ชนิด ในผักและผลไม โดยเทคนิค LC-MS/MS เมื่อพิจารณาความสมเหตุสมผลของคาความ ไมแนนอน โดยใชเกณฑการคำนวณจากคา standard deviation คาความไมแนนอนที่ควรจะเปนเทากับ 2 predicted Horwitz’s RSDr(18) เมื่อคำนวณคาความ ไมแนนอนที่ควรจะเปน เทากับ 31.6% แตจากวิธีนี้คาความ ไมแนนอนที่พิจารณาจากแหลงความไมแนนอนที่มีผล กระทบตอปริมาณสาร มีคา 26.2% ซึ่งมีคานอยกวาคาที่ ควรจะเปน พบวาวิธีวิเคราะหนี้เหมาะสมและสอดคลอง ตามเกณฑการพิจารณาความสมเหตุสมผลของคาความ ไมแนนอน จากผลการสำรวจพบการตกคางเพียง 3 ตัวอยาง จากจำนวนตัวอยางทั้งหมด 219 ตัวอยาง คิดเปนรอยละ 1.4 โดยตรวจพบสารเมพิควอตในถั่วฝกยาว 0.11 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม และสมโชกุน 0.02 มิลลิกรัมตอ กิโลกรัม ซึ่งเกินคาดีฟอลตลิมิตที่กำหนดไวสำหรับพืชได ไมเกิน 0.01 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ทั้ง 2 ตัวอยาง และพบ สารคลอรมีควอตในผักโขมแกว ปริมาณนอยกวา 0.01 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ซึ่งนอยกวาคาดีฟอลตลิมิตที่กำหนด ไวที่ระดับความเขมขน 0.1 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม ตามบัญชี หมายเลข 3 แนบทายประกาศกระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่ 387 (พ.ศ. 2560) จากผลการสำรวจดังกลาวพบวาจำนวน ตัวอยางที่พบปริมาณการตกคางนอยมาก แสดงไดวา ผูผลิตมีความตื่นตัวในการยกระดับมาตรฐานสินคาและ แรงผลักดันของภาครัฐที่มีมาตรการตรวจสอบ ผาน โครงการสำรวจและเฝาระวังการตกคางของสารเคมี

118 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Determination of Chlormequat, Diquat, Mepiquat, and Paraquat in Vegetables and Fruits Saovanee Wajasit et al. ปองกันกำจัดศัตรูพืชตกคางในผักและผลไมสดหลาย โครงการ ตลอดจนมาตรฐานการผลิตสินคาทางการเกษตร (Good Agriculture Practices: GAP) มีศักยภาพ เพียงพอที่จะผลักดันใหเกิดวงจรผักผลไมปลอดภัย (demand driven) ดังนั้นจากผลการสำรวจเบื้องตน สะทอนใหเห็นวาขอกำหนดและกฎเกณฑตางๆ เหลานี้ สามารถสรางความมั่นใจในคุณภาพและความปลอดภัย ของผักและผลไมที่จะนำมาบริโภคได สรุป วิธีวิเคราะหที่พัฒนาขึ้นสามารถใชตรวจวิเคราะห สารกลุม herbicides ได 4 ชนิด ประกอบดวย คลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ซึ่งผลการ ทดสอบความใชไดของวิธีดังกลาว พบวา calibration curve มีความเปนเสนตรงในชวง 0.01–0.20 มิลลิกรัม ตอกิโลกรัม โดยมีคา coefficient of determination ในชวง 0.975–0.999 คาเฉลี่ย %recovery อยูในชวง 66.1–117.2% และ HORRAT อยูในชวง < 0.1–1.0 มีคา LOD และ LOQ ของทุกสารเทากับ 0.005 และ 0.01 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม จากขอมูลขางตนแสดงใหเห็น วา วิธีวิเคราะหที่พัฒนาขึ้นนี้ มีคุณลักษณะเฉพาะแสดง สมรรถนะที่ผานเกณฑการยอมรับและเหมาะสม มีความ ถูกตอง แมนยำ มีความไว และความจำเพาะตอสารที่ ตองการทดสอบ ใหผลทุกพารามิเตอรผานเกณฑยอมรับ ของสากล เหมาะกับการใชงาน (fitness for intended use) สามารถนำวิธีนี้ไปใชในการตรวจวิเคราะหเพื่อ เปนการควบคุมคุณภาพอาหารตามกฎหมาย และเพื่อ ความยุติธรรมแกผูประกอบการและคุมครองผูบริโภค ตอไปได กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณนางลัดดา แกวกลาปญญาเจริญ ที่ชวย ใหคำแนะนำ ขอเสนอแนะ และสนับสนุนการศึกษาวิจัย ตลอดจนเจาหนาที่ฝายยาสัตวและวัตถุออกฤทธิ์ สำนัก คุณภาพและความปลอดภัยอาหาร ชวยเตรียมและสกัด ตัวอยาง จนทำใหงานวิจัยบรรลุผลสำเร็จในครั้งนี้ เอกสารอางอิง 1. Bauer A, Luetjohann J, Rohn S, Kuballa J, Jantzen E. Development of an LC-MS/MS method for simultaneous determination of the quaternary ammonium herbicides paraquat, diquat, chlormequat, and mepiquat in plantderived commodities. Food Anal Methods 2018; 11: 2237-43. 2. Chamkasem N, Morris CJ, Harmon T. Determination of paraquat and diquat in potato by liquid chromatography/tandem mass spectrometer. J Regul Sci 2017; 05: 1-8. 3. Pizzutti IR, Vela GM, de Kok A, Scholten JM, Dias JV, Cardoso CD, et al. Determination of paraquat and diquat: LC-MS/MS optimization and validation. Food Chem 2016; 209: 248-55. 4. กรมควบคุมมลพิษ กระทรวงวิทยาศาสตร เทคโนโลยีและ สิ่งแวดลอม. พาราควอต (Paraquat). พิมพครั้งที่ 2. กรุงเทพฯ: ฝายศูนยขอมูลสารอันตรายและอนุสัญญา กองจัดการสารอันตรายและกากของเสีย; 2541. หนา 7-12. 5. คณะแพทยศาสตรโรงพยาบาลรามาธิบดี มหาวิทยาลัย มหิดล. สารเคมีกําจัดวัชพืช (Herbicides). [ออนไลน]. 2542; [สืบคน 25 ม.ค. 2565]; [4 หนา]. เขาถึงไดที่: URL: https://med.mahidol.ac.th/poisoncenter /th/bulletin/bul99/v7n3/Herb. 6. กรมวิชาการเกษตร สํานักงานเศรษฐกิจการเกษตร. ขอมูลเศรษฐกิจการเกษตร. [ออนไลน]. 2565; [สืบคน 25 ม.ค. 2565]; [1 หนา]. เขาถึงไดที่: URL: https:// www.oae.go.th/view/1/ปจจัยการผลิต/TH-TH. 7. World Health Organization. The WHO recommended classifi cation of pesticide by hazard and guidelines to classifi cation 2000-2002 (WHO/ IPCS/01.5). [online]. 2002; [cited 25 Jan 2022]; [58 screens]. Available from: URL: https:// apps.who.int/iris/handle/10665/42524. 8. United States Environmental Protection Agency. R.E.D. FACTS paraquate dichloride. Prevention, pesticides and toxic substances (7508W). [online]. 1997; [cited 25 Jan 2022]; [12

119 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การวิเคราะหสารคลอรมีควอต ไดควอต เมพิควอต และพาราควอต ในผักและผลไม เสาวณีย วาจาสิทธิ์ และคณะ screens]. Available from: URL: https://www3. epa.gov/pesticides/chem_search/reg_actions/ reregistration/fs_PC-061601_1-Aug-97.pdf. 9. Commission Implementing Regulation (EU) 2018/1532 of 12 October 2018 concerning the non-renewal of approval of the active substance diquat, in accordance with Regulation (EC) No 1107/2009 of the European Parliament and of the Council concerning the placing of plant protection products on the market, and amending Commission Implementing Regulation (EU) No 540/2011. Official Journal of the European Union 2018: L 257/10- L 257/12. 10. พระราชบัญญัติวัตถุอันตราย พ.ศ. 2535 ประกาศ กระทรวงอุตสาหกรรม เรื่อง บัญชีรายชื่อวัตถุอันตราย ฉบับที่ 6 (พ.ศ. 2563). ราชกิจจานุเบกษา เลม 137 ตอนพิเศษ 117 ง (วันที่ 19 พฤษภาคม 2563) หนา 56. 11. พระราชบัญญัติอาหาร พ.ศ. 2522 ประกาศกระทรวง สาธารณสุข ฉบับที่ 419 (พ.ศ. 2563) เรื่อง อาหารที่ มีสารพิษตกคาง ฉบับที่ 3. ราชกิจจานุเบกษา เลม 137 ตอนพิเศษ 257 ง (วันที่ 2 พฤศจิกายน 2563) หนา 27. 12. Kaczynski P. Clean-up and matrix eff ect in LC-MS/MS analysis of food of plant origin for high polar herbicides. Food Chem 2017; 230: 524-31. 13. Halim N, Kuntom A, Shinde R, Banerjee K. Determination of paraquat residues in palm oil by high-performance liquid chromatography with UV and tandem mass spectrometry. Eur J Lipid Sci Technol 2019; 121: 1900092. (7 pages). 14. Esparza X, Moyano E, Galceran MT. Analysis of chlormequat and mepiquat by hydrophilic interaction chromatography coupled to tandem mass spectrometry in food samples. J Chromatogr A 2009; 1216: 4402-6. 15. European Commission (EURL-SRM). Quick method for the analysis of numerous highly polar pesticides in foods of plant origin via LC-MS/MS involving simultaneous extraction with methanol. (QuPPe-Method) version 8.1. [online]. 2015; [cited 25 Jan 2022]; [60 screens] Available from: URL: https://www.eurl-pesticides.eu/library/docs/srm/meth_QuPPe.pdf. 16. Commission Decision of 12 August 2002. Implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Offi cial Journal of the European Communities 2002: L221/8-L221/36. 17. Fajgelj A, Ambrus A, editors. Principles and practices of method validation. Cambridge, UK: The Royal Society of Chemistry; 2000. 18. Ellison SLR, Williams A, editors. EURACHEM/CITAC guide: quantifying uncertainty in analytical measurement. 3rd ed. United Kingdom: EURACHEM/CITAC; 2012.

120 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Determination of Chlormequat, Diquat, Mepiquat, and Paraquat in Vegetables and Fruits Saovanee Wajasit et al. Method Development and Validation of Chlormequat, Diquat, Mepiquat, and Paraquat Residue Determination in Vegetables and Fruits by LC-MS/MS Technique ABSTRACT According to the statistics on imported chemicals, herbicides, including chlormequat, diquat, mepiquat, and paraquat, have been used as weed control agents. Diquat and paraquat are the herbicides, while chlormequat and mepiquat are synthetic substances for controlling plant growth. The inappropriate use of these agents, especially paraquat, can lead to environmental contamination and cause adverse eff ects on consumers' health. WHO has categorized paraquat’s toxicity as class II, which is moderately hazardous; moreover, paraquat is also classifi ed as a category 4 hazardous substance according to the Hazardous Substances Act, B.E. 2563 (2020). This research aimed to develop and validate the analysis method for the four “quat” substances in fruits and vegetables. Firstly, the sample extraction was undertaken by using acidifi ed methanol, and then centrifuged. After that, the extraction solution was examined to identify and quantify the herbicide residues by LC-MS/MS. The results indicated that the LOD and LOQ were 0.005 and 0.010 mg/kg, respectively, and the linearity was shown in the range of 0.01–0.20 mg/kg. The accuracy of this method was approximately 66.2–117.2%, and the precision was between 0.4% and 14.5%. This method has been recognized as ISO/IEC 17025:2017 accredited method since 2020. Therefore, it is suitable to be applied in a laboratory for consumer protection and law enforcement purposes. This method was also used to survey the contamination of these substances in 219 fresh vegetables and fruits in 2020. It was found that three samples contained herbicide residues: mepiquat in two samples and chlormequat in the other one, while paraquat residues were not detected in any of the three samples. Keywords: Chlormequat, Diquat, Mepiquat, Paraquat, Vegetables and Fruits Saovanee Wajasit, Suwimol Muadmah, Atcharee Inkaew, Kanyarat Chuakunchat, Witthawat Wangkaewhiran, Sakulrat Somsuntisuk, and Thongsuk Payanan Bureau of Quality and Safety of Food, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand

นิพนธตนฉบับ ว กรมวิทย พ 2565; 64 (2): 121-132 121 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 โสมมริสา พวงพรศรี อัศจรรย อาเมน ปทมา บุนนาค ฐิตาภรณ ภูติภิณโยวัฒน ชาญวิทย ชูแกว และ ไพศาล พังจุนันท สถาบันชีววัตถุ กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000 การประเมินคุณภาพสารมาตรฐาน Factor VIII แบบผงแหงเพื่อทดสอบคาความแรง บทคัดยอ Factor VIII เปนยาชีววัตถุสําหรับรักษาโรคฮีโมฟเลีย ชนิดเอ โดยปริมาณยาที่ฉีดใหผูปวยขึ้นกับระดับความรุนแรง และความเขมขนที่ระบุบนขวดยา ในการทดสอบความแรงโดยวิธีเปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอางอิงจะทําใหทราบปริมาณ ความเขมขนที่มีหนวยเปน international units (IU) ได การศึกษานี้มีวัตถุประสงคเพื่อเตรียมและประเมินคุณภาพสาร มาตรฐาน Factor VIII แบบผงแหงที่ผลิตโดยสถาบันชีววัตถุ เพื่อนําไปใชสําหรับการทดสอบคาความแรงของผลิตภัณฑ Factor VIII ผลการประเมินสารมาตรฐานอางอิง Factor VIII แบบผงแหงดังกลาว พบวามีคารอยละสัมประสิทธิ์ ความแปรปรวนการแบงบรรจุเทากับ 0.18 คาความแรงเฉลี่ยเทากับ 16.26 IU/ขวด และคารอยละความชื้นเฉลี่ยเทากับ 1.77 ผลการประเมินความเปนเนื้อเดียวกันไมมีความแตกตาง และมีลักษณะทางกายภาพและความสามารถละลายที่ดี มีคาความเปนกรด-ดาง เทากับ 8.517 การศึกษาความคงตัวแบบ long term เก็บรักษาในสภาวะปกติอุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียส พบวาที่ 150 วัน คาความแรงไมลดลง การศึกษาความคงตัวในสภาวะเรงพบลักษณะทางกายภาพและ คาความเปนกรด-ดางปกติ มีคารอยละความชื้นที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส สูงกวาที่ 4 และ 25 องศาเซลเซียส และ ความแรงที่อุณหภูมิ 25 และ 37 องศาเซลเซียส มีคาลดลงในวันที่ 3 และ 7 ดังนั้น Factor VIII ชนิดผงแหง สามารถใชเปน สารมาตรฐานสําหรับการทดสอบความแรงผลิตภัณฑ Factor VIII ได โดยมีการนํามาทดสอบคาความแรงทุก 6 เดือน เพื่อ ติดตามประสิทธิภาพความคงตัว คําสําคัญ: สารมาตรฐาน Factor VIII แบบผงแหง, ความแรง, ความคงตัว Corresponding E-mail: [email protected] Received: 18 March 2022 Revised: 11 May 2022 Accepted: 31 May 2022

, Factor V และ VIII ซึ่งจะชวยเพิ่มประสิทธิภาพ ของกลไกลการเกิดลิ่มเลือดจนสุดทายทำให fibrinogen เปลี่ยนเปน fibrin เกิดเปนลิ่มเลือดที่บริเวณบาดแผล จากการศึกษาที่ผานมาตั้งแตป ค.ศ. 1964 พบวากลไก การแข็งตัวของเลือดอธิบายผานกลไกที่เรียกวา cascade model(1) ดังแสดงในภาพที่ 1 โดยเชื่อวาเปนการกระตุน ผาน intrinsic pathway และ extrinsic pathway ซึ่งทั้งสองสวนทำงานรวมกันกระตุนปจจัยการแข็งตัวของ เลือดใน common pathway ไดเปน fibrin clot มีการ ศึกษาตอมาพบวารูปแบบนี้มีขอบกพรองโดยไมสามารถ อธิบายพยาธิสภาพที่เกิดขึ้นจริงบางอยาง เชน ไมพบ วามีภาวะเลือดออกผิดปกติในผูที่ขาด contact factor ตั้งแตกำเนิด จึงนำไปสูแนวคิดใหมของกลไกลการแข็ง ตัวของเลือดที่เรียกวา cell-based model coagulation ดังแสดงในภาพที่ 2 ซึ่งกระบวนการกระตุนการเกิด ลิ่มเลือดจะเกิดบนผิวเซลลเปนหลัก โดยแบงไดเปน 3 ระยะ คือ 1) initiation phase เมื่อเกิดบาดแผล TF จะกระตุน Factor VII เกิดเปน Factor VIIa (active)/ TF complex ที่จะกระตุนเปลี่ยน Factor X เปน Xa ซึ่ง Factor Xa จะเปลี่ยน prothrombin เปน thrombin ในปริมาณนอยๆ 2) ระยะ amplification phase ปริมาณ thrombin จากระยะที่ 1 จะกระตุนปจจัยการ แข็งตัวของเลือดชนิด Factor V, VIII, XI และ XIII ใหอยูในรูป active form ที่สามารถเปลี่ยน Factor IX เปน IX ที่ active และเกิดการขยายสัญญาณการกระตุน การเกิดลิ่มเลือดใหเพิ่มขึ้นอยางรวดเร็ว และ 3) propagation phase เปนการทำงานรวมกันของ Factor IXa และ VIIIa ทำหนาที่กระตุนเปลี่ยน factor X ให active สามารถเปลี่ยน prothrombin ใหเปน thrombin ได ปริมาณมากๆ ซึ่งจะเปลี่ยนเปน fibrinogen ในทายที่สุด ภาพที่ 1 การกระตุนการแข็งตัวของเลือดแบบ cascade model แบงเปน 3 สวน คือ intrinsic pathway, extrinsic pathway และ common pathway(1)

123 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 การประเมินคุณภาพ Factor VIII แบบผงแหง โสมมริสา พวงพรศรี และคณะ โรคฮีโมฟเลีย คือ โรคเลือดออกไหลไมหยุดหรือ เลือดออกงายหยุดยาก เปนโรคที่ถายทอดทางพันธุกรรม เกิดจากการกลายพันธุของยีน โรคฮีโมฟเลียมี 2 ชนิด คือ ฮีโมฟเลีย A เกิดจากการขาดโปรตีน Factor VIII และ ฮีโมฟเลีย B เกิดจากการขาดโปรตีน Factor IX สาเหตุ ของโรคฮีโมฟเลียเกิดจากความผิดปกติบนโครโมโซม เพศชนิด X ทำใหมักเกิดโรคในเพศชาย และเปนยีนแฝง ในเพศหญิงทำใหโรคสามารถถายทอดความผิดปกติให บุตรเพศชายได อุบัติการณของโรคในประเทศไทยเทากับ 1 ตอ 13,000–20,000 ของประชากร และชวงอายุผูปวย ที่พบมากที่สุด คือ เด็กเล็กอายุนอยกวา 2 ป อาการของ โรคจะมีเลือดออกงาย โดยอาการจะเปนๆ หายๆ ตั้งแต เด็ก รวมถึงอาการฟกช้ำ เลือดออกในกลามเนื้อและ ขอตอ อาการเลือดออกที่คงอยูนานหลังการบาดเจ็บ เล็กนอยหรือการผาตัด และอาจรุนแรงหากมีเลือดออก ในอวัยวะที่สำคัญ เชน ที่สมอง การวินิจฉัยโดยสังเกต จากอาการ การเจาะเลือดตรวจระดับ Factor VIII และ การตรวจชิ้นเนื้อรกหรือการเจาะน้ำคร่ำในระหวางตั้ง ครรภ ความรุนแรงของโรคสามารถแบงเปน 3 ระดับ คือ ความรุนแรงมาก พบปจจัยการแข็งตัวของเลือดนอย กวา 1% มีโอกาสเลือดออกไดเองหรือเลือดออกภายหลัง บาดเจ็บเล็กนอย ความรุนแรงปานกลาง พบปจจัยการ แข็งตัวของเลือด 1–5% จะมีเลือดออกเมื่อกระแทกหรือ เกิดการลม ความรุนแรงนอย พบปจจัยการแข็งตัวของ เลือด 5–40% จะมีเลือดออกมากเมื่อเกิดการบาดเจ็บ รุนแรง โรคฮีโมฟเลียไมสามารถรักษาใหหายขาดได การ รักษาโรคฮีโมฟเลียทำไดโดยการให factor ซึ่งชวยให ผูปวยมีคุณภาพชีวิตที่ดีขึ้น มี 2 รูปแบบ คือ การใหแบบ ตามอาการ เปนการใหเมื่อผูปวยไดรับอุบัติเหตุหรือมี เลือดออกจากการกระแทก และการใหแบบปองกัน เปน การใหสม่ำเสมอเปนประจำแมจะไมมีอาการ เชน สัปดาห ละครั้ง ปริมาณยาที่ใหผูปวยกำหนดตามความรุนแรงของ โรคฮีโมฟเลีย ซึ่งคำนวณจากปริมาณ Factor VIII ที่ระบุ บนขวดยา(2) ผลิตภัณฑ Factor VIII เปนยาชีววัตถุ แบงได เปน 2 ชนิด ตามวิธีการผลิต คือ ชนิดที่ผลิตจากพลาสมา มนุษย เปนการนำเลือดที่ไดรับจากการบริจาค นำมา ปนเก็บพลาสมาและผานกระบวนการผลิต โดยแยกสาร ออกฤทธิ์จากสวนประกอบอื่นๆ ที่ไมตองการดวย ขบวนการตกตะกอนโดยการเติมสารเคมี สวนอีกชนิด คือ recombinant Factor VIII มีกระบวนการผลิต ดวยเทคโนโลยีทางชีวภาพ เปนการตัดตอยีนเขาไป ในเวคเตอรแลวนำเขาไปในเซลลสิ่งมีชีวิตเพื่อใหผลิต โปรตีนที่ตองการ สถาบันชีววัตถุเปนหนวยงานภาครัฐ ทำหนาที่ควบคุมกำกับยาชีววัตถุที่ใชภายในประเทศ การควบคุมคุณภาพผลิตภัณฑทางหองปฏิบัติการ ประกอบดวยการทดสอบลักษณะทางกายภาพ เคมี ความ ปลอดเชื้อ และความแรง สำหรับการทดสอบความแรง ภาพที่ 2 การกระตุนการแข็งตัวของเลือดแบบ cell-based model ประกอบดวยการทำงานตอเนื่องกัน 3 ระยะ คือ initiation phase, amplification phase และ propagation phase(1)

124 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 2 เมษายน - มิถุนายน 2565 Evaluation of Factor VIII Freeze-Dried Soammarisa Paungpornsri et al. โดยวิธีตามมาตรฐานสากล European Pharmacopeia(3) จะใชวิธี chromogenic assay ซึ่งเปนการทดสอบ เปรียบเทียบกับสารมาตรฐานอางอิงที่ทราบคาความแรง แลววิเคราะหรายงานคาความแรงที่มีหนวยเปน international unit (IU) ซึ่งสารมาตรฐาน Factor VIII ที่ใช สำหรับงานทดสอบความแรงของผลิตภัณฑ Factor VIII นั้นจะไดรับการสนับสนุนโดยการสั่งซื้อจาก National Institute of Biological Standard and Control (NIBSC) ประเทศสหราชอาณาจักร แตเนื่องจากเปน สารมาตรฐานที่ใชทั่วโลก NIBSC จึงจำกัดจำนวนการสั่ง ซื้อ ทำใหมีโอกาสไมเพียงพอตอการใชงาน อีกทั้ง Factor VIII เปนชีวโมเลกุลที่มีความซับซอนและมีความคงตัวต่ำ เกิดการเปลี่ยนแปลงของโครงสรางงายเมื่ออยูในสภาวะ ที่ไมเหมาะสม เชน pH หรือ อุณหภูมิ(4) ดังนั้นเมื่อเปด ใชงานละลายผงแหงแลวไมสามารถแบงเก็บเพื่อนำมา ทดสอบซ้ำไดอีก การศึกษานี้มีวัตถุประสงคเพื่อเตรียมและประเมิน คุณภาพสารมาตรฐาน Factor VIII แบบผงแหงที่ผลิต โดยสถาบันชีววัตถุ กรมวิทยาศาสตรการแพทย เพื่อนำไป ใชสำหรับการทดสอบคาความแรงของผลิตภัณฑ Factor VIII ที่ใชในประเทศ วัสดุและวิธีการ สารเคมี ตัวอยาง ชุดน้ำยาทดสอบ สารอางอิง WHO International Standard 8th INTERNATIONAL STANDARD FACTOR VIII CONCENTRATE NIBSC code: 07/350, ชุดทดสอบ HemosIL Electrachrome Factor VIII (บริษัท Instrumentation Laboratory, USA), ผลิตภัณฑ FACTOR VIII TRCS 500 ผลิตโดยศูนยผลิต ผลิตภัณฑจากพลาสมา สภากาชาดไทย, formulation buffer (2X) ประกอบดวย 50 mM Tris buffer pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1% w/v trehalose และ 1% human albumin, fluid thioglycollate broth, tryptic soy broth เครื่องมือและวัสดุอุปกรณ กลองจุลทรรศนควบคุมอุณหภูมิ รุน Axio LabA1 (บริษัท Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany), เครื่องทำแหงแบบเยือกแข็ง รุน LyoLab (บริษัท Lyophilization Systems Inc., USA), เครื่องวิเคราะห ไอออน รุน EA940 (บริษัท Orion Inc., USA), เครื่องวิเคราะหหาปริมาณน้ำแบบคารลฟชเชอร รุน 852 Titrando (บริษัท Metrohm, Switzerland), เครื่อง Microplate reader รุน ELx808 (บริษัท BioTek Instruments, USA), เครื่องทดสอบความปราศจากเชื้อ SteritestTM Compact (บริษัท Merck, Germany), และชุดกรองทดสอบความปราศจากเชื้อ Steritest canister (บริษัท Merck, Germany) การเตรียม Factor VIII และการบรรจุ ผลิตภัณฑ FACTOR VIII ขนาด 500 IU ไดรับ จากศูนยผลิตผลิตภัณฑจากพลาสมา สภากาชาดไทย แลว นำมาเตรียมสารมาตรฐาน Factor VIII 80 IU/มิลลิลิตร ดวย formulation buffer แบงบรรจุปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร (40 IU/ขวด) ลงขวดแกว (borosilicate glass type I) ขณะบรรจุใหผสมโดยใชแทงเหล็กกวนตลอด เวลา ปดจุกยางในระดับครึ่งจุกยาง แลวนำเขาเครื่องทำ แหงแบบเยือกแข็งภายในหองปลอดเชื้อ กระบวนการทำแหงแบบเยือกแข็ง การทำแหงแบบเยือกแข็งดวยเครื่องทำแหงแบบ เยือกแข็ง การศึกษาหาคาปจจัยที่สำคัญของการทำแหง แบบเยือกแข็งที่ผานมาของการเตรียมสารมาตรฐานแบบ แหงของสถาบันชีววัตถุ(5,6) ทำโดยตั้งคาโปรแกรมการ ทำแหงของเครื่องดังนี้ กำหนดคาอุณหภูมิแชแข็งเทากับ -60 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3 ชั่วโมง เพื่อใหเกิดการ เยือกแข็ง (freeze) โดยสมบูรณ ในขั้นปฐมภูมิของ กระบวนการทำแหง (primary drying process) เพิ่ม อุณหภูมิจาก -60 เปน -40 องศาเซลเซียส และกำหนด ความดันที่ 100 mTorr เปนเวลา 63 ชั่วโมง จากนั้น ขั้นทุติยภูมิของกระบวนการทำแหง (secondary drying process) ปรับเพิ่มอุณหภูมิเปน 20 องศาเซลเซียส ความดันเทาเดิม นาน 14 ชั่วโมง สารมาตรฐาน Factor VIII ที่เตรียมเสร็จแลวเก็บรักษาที่อุณหภูมิ -70 องศา เซลเซียส การนำมาศึกษาคุณภาพใหละลายดวยน้ำกลั่น 1 มิลลิลิตร (water for injection, WFI)